• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제30권1호
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• pp.109-117
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• 2020

Cre recombinase is widely used to manipulate DNA sequences for both in vitro and in vivo research. Attachment of a trans-activator of transcription (TAT) sequence to Cre allows TAT-Cre to penetrate the cell membrane, and the addition of a nuclear localization signal (NLS) helps the enzyme to translocate into the nucleus. Since the yield of recombinant TAT-Cre is limited by formation of inclusion bodies, we hypothesized that the positively charged arginine-rich TAT sequence causes the inclusion body formation, whereas its neutralization by the addition of a negatively charged sequence improves solubility of the protein. To prove this, we neutralized the positively charged TAT sequence by proximally attaching a negatively charged poly-glutamate (E12) sequence. We found that the E12 tag improved the solubility and yield of E12-TAT-NLS-Cre (E12-TAT-Cre) compared with those of TAT-NLS-Cre (TAT-Cre) when expressed in E. coli. Furthermore, the growth of cells expressing E12-TAT-Cre was increased compared with that of the cells expressing TAT-Cre. Efficacy of the purified TAT-Cre was confirmed by a recombination test on a floxed plasmid in a cell-free system and 293 FT cells. Taken together, our results suggest that attachment of the E12 sequence to TAT-Cre improves its solubility during expression in E. coli (possibly by neutralizing the ionic-charge effects of the TAT sequence) and consequently increases the yield. This method can be applied to the production of transducible proteins for research and therapeutic purposes.

• 한국생물공학회:학술대회논문집
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• 한국생물공학회 2000년도 추계학술발표대회 및 bio-venture fair
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• pp.721-724
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• 2000

재조합 단백질 생산에서 문제가 되고 있는 번역 후 과정인 glycosylation 을 in vitro 상에서 수행하였다. 원핵생물 시스템에서 재조합 단백질을 생산하고, 이후 효소를 이용하여 올리고당을 붙여 원래의 당단백질과 유사한 단백질을 생산하는 것이 산업적으로 경쟁력을 가질 수 있으므로 이를 위하여 glucose oxidase와 fetuin을 모델 당단백질로, 가수분해 효소인 peptide-N-glycosidase F 의 역반응 활성을 이용하여 glycosylation 을 시도하였다. 역가수분해로의 평형 이동을 위하여 그 기질인 올리고당과 암모니아를 과량 첨가하고, 반응 온도를 높였다. Glucose oxidase의 경우에는 denaturation 했을 때 완전한 deglycosylation 이 일어났지만, fetuin의 경우에는 그렇지 못했다. Glucose oxidase 의 glycosylation 은 수용액상에서는 불가능 했지만 acetone 을 media로 사용하여 $50^{\circ}C$에서 4 시간동안 반응시켰을 때 SDS-PAGE 분석 결과 reglycosylation이 일어나 단백질 밴드가 위로 올라감을 관찰할 수 있었다.

• KSBB Journal
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• 제23권3호
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• pp.231-238
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• 2008

암세포의 침윤은 숙주 조직의의 기저막과 세포외 기질을 침투함으로써 일어난다. 침윤과 전이과정에는 단백질가수분해 효소인 matrix metalloproteinases (MMPs)가 깊이 연관되어 있는 것으로 알려져 있으며, MMP의 가수분해 활성은 tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs)라는 억제 단백질에 의해 억제된다. TIMP-2는 21kDa 크기의 포유류 단백질로 대장균에서 과발현 시 다른 많은 포유류 단백질과 마찬가지로 가용성이 낮은 봉입체 형태로 발현된다. TIMP-2 단백질의 접힘에 6개의 이황화결합이 필요하고, 이는 일반적으로 대장균 환경은 적합하지 않다. 본 연구에서는 대장균에서 불가용성으로 발현되는 TIMP-2 유전자를 유전자셔플링 기법의 한 가지인 StEP (staggered extension process)를 변형하고 동시에 $Mn^{2+}$ 농도 변화와 dGTP 불균형을 이용한 무작위 돌연변이 기법을 혼용하여 대장균에서 가용성 TMP-2 재조합 변이체를 생성하고자 하였다. 무작위로 재조합된 TIMP-2 유전자 중에서 가용성으로 발현되는 TIMP-2 유전자를 선별하기 위해서 chloramphenicol acetyltransferase (CAT)-융합 방법을 도입하였다. CAT 유전자가 가용성으로 발현되는 재조합 TIMP-2 유전자에 융합되면 이를 갖는 E. coli는 높은 chloramphenicol 환경에서 생존이 가능하게 된다. 이러한 in virro mutageuesis 기법과 CAT-융합 방법으로 대장균 가용성 TIMP-2 재조합 변이체를 14가지 얻을 수 있었다. 변이체 TIMP-2의 아미노산서열 분석과 구조 분석 결과 주로 소수성 아미노산이 친수성 아미노산으로 전환되었고, MMP와의 결합이 관여하지 않는 C-말단 부위에 돌연변이가 집중되어 있었다. 본 연구에서 개발된 간편하고 새로운 in vitro 재조합 방법과 CAT을 이용한 스크리닝 기법은 다른 많은 대장균 내 불가용성 단백질의 발현에도 사용될 수 있을 것으로 사료된다.

• 한국초지조사료학회지
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• 제32권1호
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• pp.59-74
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• 2012

본 시험에서 건초(티머시, 알팔파 및 클라인)와 짚류(톨페스큐 및 볏짚)의 buffer 용해도와 단백질 분획이 실시되었으며, 조사료 자원의 buffer 추출이 $In$ $vitro$ 발효 성상, 분해율 및 가스($CO_2$ 및 $CH_4$) 생성량에 미치는 효과를 조사하였다. 다른 조사료에 비해 총 단백질 중 buffer 가용성 조단백질과 A fraction은 알팔파 건초에서 각각 61% 및 41.77%로 가장 높았으며 볏짚에서 가장 낮았다(각각 42.8% 및 19.78%). 총단백질 중 B1 fraction은 조사된 조사료간 비교적 큰 차이를 보이지 않았으나 B2 fraction에서는 다른 조사료(6.34~8.85%)에 비하여 톨페스큐짚(10.05%) 및 클라인 건초(12.34)%에서 다소 높은 수준을 보였다. 총 단백질 중 B3 fraction이 차지하는 비율은 톨페스큐짚에서 38.49%로 가장 높았으나 다른 조사료 자원 간에는 큰 차이가 없었으며, C fraction의 경우 볏짚에서 가장 높은 비율(15.05%)을 보였다. 모든 사료에서 배양 개시 후 3시간(P<0.01) 및 6시간(P<0.05)에서 buffer 추출 전에 비해 추출 후 배양액의 pH가 증가되었으며, 배양 6시간(P<0.05) 및 12시간(P<0.001)에서 다른 사료에 비해 티모시 건초 및 알팔파 건초로부터의 pH가 낮았다. 배양액의 암모니아 농도는 모든 배양시간에서 가용성 물질의 추출 전 후에 다른조사료에 비해 알팔파 건초에서 가장 높았으나 모든 사료의 추출효과는 배양 3시간(P<0.01)에서만 나타났다. 배양액의 총 VFA 농도는 배양 24시간까지 알팔파 건초에서 가장 높았던 반면 톨페스큐짚과 볏짚에서 가장 낮았다. 또한 모든 조사료에서 buffer 추출 전에 비하여 추출후에 총 VFA 농도가 감소되었다(P<0.01~P<0.001). Acetic acid ($C_2$)의 조성 비율에서는 배양 6시간까지 추출 전에 더 높았으나(P<0.001) 사료 간 차이는 없었다. Propionic acid ($C_3$) 조성 비율 역시 배양 개시 후 3, 24 및 48시간(P<0.001)에서 추출 전에 더 높았으며, 6 및 12 시간의 배양액에서 대부분 건초(티모시, 알팔파 및 클라인)와 짚류(톨페스큐짚 및 볏짚) 간 차이가 있는 것으로 조사되었다(P<0.05). 그러나 butyric acid ($C_4$) 조성비율의 경우 대부분의 배양시간에서 사료 간 차이는 없었다. 건물에서의 분해율 관련 parameter 중 a 값은 조사된 전체 조사료에서 buffer 추출 전이 추출 후에 비해서 높았으며(P<0.001), 다른 조사료에 비해 톨페스큐짚과 볏짚에서 크게 낮았다(P<0.05). 또한 b 값의 경우 역시 추출 전에 비해 추출 후에서 현저히 낮았으나(P<0.001) 사료 간 차이는 없었다. 볏짚을 제외한 조사료에서 추출 후에 비해 추출 전의 건물 유효분해율(EDDM)이 더 높았다(P<0.001). 조단백질에서의 a, b 및 c 값은 추출 전에 비해 추출 후에서 현저히 낮았으나(P<0.05) 사료 간 차이는 없었다. 조단백질 유효분해율(EDCP)에서는 다른 조사료 종류에 비해 톨페스큐짚과 볏짚에서 낮았다(P<0.05). 한편, NDF의 경우 a 값과 b 값(P<0.01) 및 NDF 유효분해율(EDNDF, P<0.001)은 추출 후에 비해 추출 전에 더 높았으나(P<0.01) 사료 간 차이는 보이지 않았다. 반추위미생물에 의해 사료분해과정 중 생성되는 $CO_2$ 량도 24시간 배양까지는 추출 전에 더 많았으며(P<0.05~P<0.001), 톨페스큐짚과 볏짚에 비해 건초 형태의 조사료로부터의 $CO_2$ 생성량이 더 많았다(P<0.05~P<0.01). 메탄가스($CH_4$) 생성량 역시 모든 배양시간에서 추출 전에 비해 추출 후에 크게 감소되었으며(P<0.01~P<0.001), 12~24시간을 제외하고는 짚류에 비해 건초에서 현저히 높은(P<0.05) 것으로 나타났다. 본 시험의 결과를 종합하면, 조사료 자원에 대한 buffer 용해도와 단백질의 분획이 $In$ $vitro$ VFA 농도와 분해율 및 gas ($CO_2$ 및 $CH_4$) 발생량 간 상호 밀접한 관계를 보이는 것으로 여겨진다. 이에 따라 조사료 이용 효율 개선을 위해 조사료자원에 대한 buffer 용해도와 단백질 분획을 반추동물 TMR 조제에 활용할 필요가 있는 것으로 여겨진다.

• Molecules and Cells
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• 제46권12호
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• pp.764-777
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• 2023

Recombinant immunotoxins (RITs) are fusion proteins consisting of a targeting domain linked to a toxin, offering a highly specific therapeutic strategy for cancer treatment. In this study, we engineered and characterized RITs aimed at mesothelin, a cell surface glycoprotein overexpressed in various malignancies. Through an extensive screening of a large nanobody library, four mesothelin-specific nanobodies were selected and genetically fused to a truncated Pseudomonas exotoxin (PE24B). Various optimizations, including the incorporation of furin cleavage sites, maltose-binding protein tags, and tobacco etch virus protease cleavage sites, were implemented to improve protein expression, solubility, and purification. The RITs were successfully overexpressed in Escherichia coli, achieving high solubility and purity post-purification. In vitro cytotoxicity assays on gastric carcinoma cell lines NCI-N87 and AGS revealed that Meso(Nb2)-PE24B demonstrated the highest cytotoxic efficacy, warranting further characterization. This RIT also displayed selective binding to human and monkey mesothelins but not to mouse mesothelin. The competitive binding assays between different RIT constructs revealed significant alterations in IC₅₀ values, emphasizing the importance of nanobody specificity. Finally, a modification in the endoplasmic reticulum retention signal at the C-terminus further augmented its cytotoxic activity. Our findings offer valuable insights into the design and optimization of RITs, showcasing the potential of Meso(Nb2)-PE24B as a promising therapeutic candidate for targeted cancer treatment.

• 한국식품영양과학회지
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• 제17권4호
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• pp.312-319
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• 1988

정어리 단백질의 가수분해물로 합성한 plastein을 새로운 식품소재로서 고도이용 가능성을 구명하기위해 그의 기능성을 FPC 및 egg albumin과 비교검토하였으며, 아울러 소화율과 소화액의 관능검사도 실시하였다. 용해도는 plastein 제품이 FPC 보다 높았으며 glu-papain plastein은 pH변화에 관계없이 용해도가 84%로 높았으나 leu-papain plastein은 용해도가 매우 낮았다. 분산성은 plastein 제품이 egg albumin의 분산성에 비해 낮았으나 FPC보다는 월등히 높았다. Glu-papain plastein이 70.8%로 분산성이 가장 높았으나 pepsin plastin은 58.0%로 가장 낮았다. 보수력은 plastein제품이 FPC보다 약간 낮았으나 egg albumin보다 높았다. 지방흡수력은 leu-papain plastein이 2.2m1/ g 로서 가장 높았으나 glu-papain plastein이 1.6m1/ g 로 가장 낮았다. 유화성은 leu-papain plastein이 66.4%로 가장 높았으나 glu-papain plastein 51.2%로 가장 낮았다. 유화안정성도 이와 비슷한 경향이었다,. 포말성은 leu-papain plastein이 460%로서 egg albumin보다 4.6배 이상이었으며, 다른 plastein도 FPC보다 월등히 높았다. 포말안정성도 plastein이 egg albumin보다 좋았다. 점도는 glu-papain plastein을 제외한 plastein이 egg albumin에 비해 낮았다. In Vitro소화율은 $68.4{\sim}78.0%$였으며 glu-papain plasteul의 경우, molsin과 pretense같은 미생물 효소에 의한 plastein 소화액은 감칠맛이 매우 강하여 맛 강화제로서 이용이 가능할 것으로 판단되었다.

• 한국식품과학회지
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• 제22권5호
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• pp.596-601
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• 1990

미강의 산소 농도를 제한하고 상대습도 65% 온도 $35^{\circ}C$의 저장 조건하에서 함유 지방질의 가수분해를 최대한 유도한 시료와 온도 $25-30^{\circ}C$, 상대습도 70-80%인 공기중에 방치하여 함유 지방질의 가수분해와 지방질의 산화를 동시에 유도한 미강을 시료로 하여 지방의 산화양상에 따른 단백질의 물리 화학적인 변화 즉, sulfhydryl과 disulfide group, 단백질의 용해도, 유효성 lysine, protease의 활성변화 등을 실험하였다. 산소 농도를 제한한 system에서는 지방질의 가수분해는 급격히 일어난 반면 산화는 서서히 진행되었고, 공기 중에 방치한 system에서는 지방질의 가수분해와 자동산화가 현저하게 진행되었다. 이때 각종 단백질 기능기의 함량의 감소현상은 저장기간보다 지방의 산패 정도와 더 깊은 상관성을 보였다. 지방질의 산패와 주요 단백질 기능기함량과의 상관계수는 두 system 모두에서 -0.8 이상으로서, 지방질의 산패는 단백질의 이화학적인 변화에 중요한 영향을 미침이 관찰되었다(p<0.05).

• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제15권10호
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• pp.1507-1516
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• 2002

Meat and bone meal is a valuable protein and mineral source in diets of production animals and contributes to the protein, energy and mineral component of diets. The aim of the present study was to more accurately characterise the apparent ileal amino acid digestibility of meat and bone meals produced in New Zealand and evaluate routine in vitro assays used in practise to measure meat and bone meal quality. A total of 94 commercial meat and bone meals from 25 New Zealand rendering plants over a two and a half year period were analysed for proximates, gross energy, gross amino acid content (incl. hydroxyproline, hydroxylysine and lanthionine), apparent ileal amino acid digestibility, pepsin nitrogen digestibility, protein solubility and bone content. The mean crude protein content of the 94 meat and bone meal samples was 56.8% with a range of >35% units and a coefficient of variation of 9.8%. The mean crude fat and ash content were 10.0 and 28.4% respectively. These latter components showed a large range (16 and 43%, respectively) with coefficients of variation above 22%. Amino acid digestibility between samples was highly variable with lysine and sulphur amino acids digestibility ranging between 45.8-89.0 and 38.2-85.5%, respectively. Pearson correlation coefficients are presented between crude protein content and individual gross amino acids, crude protein content and individual digestible amino acid content, and pepsin N digestibility and individual digestible amino acid content. There was a significant relationship between the digestible amino acid nitrogen content and the crude protein content while pepsin nitrogen digestibility was not correlated to ileal amino acid nitrogen digestibility (r=-0.06). Meat meals with a high protein content had relatively low hydroxyproline and hydroxylysine levels something that was attributed to the levels of collagen from bone. The data indicated that lanthionine (formed upon heat treatment of cysteine with a hydroprotein) is not a good indicator of the heat treatment employed to meat and bone meals. Step-wise multiple regression equations to predict the apparent digestible content of amino acids from rapid in vitro assays are presented. The most selected variables included ash and crude fat content. In general the equations derived for the essential amino acids had a higher degrees of fit (R2) compared to the non-essential amino acids. The R2 for the essential amino acids ranged from 0.43 for histidine and 0.68 for leucine. These equations provide a means of more rapidly estimating the apparent ileal digestible amino acid content (protein quality) of meat and bone meal using standard analyses.

• 한국수산과학회지
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• 제19권5호
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• pp.493-501
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• 1986

단백질의 어떠한 가열변성 정도에서 소화율 저하에 영향을 미치는 lipid-protein complex가 가장 많이 형성되는 가를 구명하기 위하여 도다리(Pleuronichthys cornutus) 육단백질을 가열변성시키고 four-enzyme system을 이용하여 in vitro digestibility를 측정하였으며, 여기에 도다리 육에서 추출한 지질을 첨가하여 lipid-protein complex가 형성되는 현상을 조사한 결과는 다음과 같다. In vitro digestibility는 5분간 자숙하였을 때 생시료가 $88.09\%$, 탈지시료가 $90.56%$이었으며, 40분 후에는 각각 $85.95\%,\;86.17\%$를 나타내었다. Microwaving의 경우 1분 가열 후의 소화율은 생시료가 $87.41%$, 탈지시료는 $91.47\%$이었고, 7분 가열 후에는 $3{\sim}4\%$ 정도가 감소하였다. lipid-protein complex 생성에 기인된 것으로 생각되는 trypsin indigestible substrates(TIS)는 가열시간, 첨가되는 지질의 양, 상호작용시간에 따라 증가하는 경향을 나타내었다. 도다리 육에서 추출한 지질의 주요 지방산은 $C_{16:0},\;C_{16:1},\;C_{18:1},\;C_{20:5},\;C_{22:6}$이었고, 가열시간에 따른 지방산 조성의 변화는 거의 없었으며. 불포화지방산의 함량이 $67\%$ 정도를 차지하였다. POV, COV의 증가와 함께 갈변물질의 생성이 증가하였고, 단백질 용해도는 microwaving하였을 때 가장 낮았다($19.l9\%$). lipid-protein 상호작용에서 지질의 함량이나 산화정도가 효소적 소화에 가장 큰 저해인자로 작용하였으며, 생시료 및 탈지시료에 지질을 섞어 가열처리하면서 반응시킨 것과 단백질을 가열변성시킨 후 지질을 첨가하여 반응시킨 것을 비교하면 lipid-protein 상호작용으로 인하여 전자가 후자보다 낮은 소화율을 나타내어 단백질과 지질의 상호작용은 단백질 변성현상과 동시에 일어날 가능성이 높음을 알 수 있었다.

• BMB Reports
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• 제49권9호
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• pp.455-456
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• 2016

Mutations of APC and KRAS are frequently observed in human colorectal cancers (CRCs) and the Wnt/β-catenin and Ras pathways are consequently activated in a significant proportion of CRC patients. Mutations in these two genes are also known to synergistically induce progression of CRCs. Through a series of studies, we have demonstrated that inhibition of the Wnt/β-catenin signaling pathway negatively regulates Ras stability, therefore, Ras abundance is increased together with β-catenin in both mice and human CRCs harboring adenomatous polyposis coli (APC) mutations. In a recent study, we identified KY1220, a small molecule that simultaneously degrades β-catenin and Ras by inhibition of the Wnt/β-catenin pathway, and obtained its derivative KYA1797K, which has improved activity and solubility. We found that KYA1797K binds the RGS domain of axin and enhances the binding affinity of β-catenin or Ras with the β-catenin destruction complex components, leading to simultaneous destabilization of β-catenin and Ras via GSK3β activation. By using both in vitro and in vivo studies, we showed that KYA1797K suppressed the growth of CRCs harboring APC and KRAS mutations through destabilization of β-catenin and Ras. Therefore, our findings indicate that the simultaneous destabilization of β-catenin and Ras via targeting axin may serve as an effective strategy for inhibition of CRCs.