• Mycobiology
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• 제31권4호
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• pp.196-199
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• 2003

A very reliable and specific method for the identification of fungi in ectotrophic mycorrhizal symbiosis was developed using a specific PCR assay based on the amplification of the ITS1 region. To obtain specific data, an ITS-diagnostic assay was carried out that reveals genera and species specific sequences. Here, an application of one method is presented, which covers the identification of pure mycelia, basidiocarps as well as mixed samples such as ectomycorrhizal roots that were mingled with remains of the host plant. For this purpose a protocol was established that allowed the extraction of DNA from single mycorrhizal roots. In order to perform a specific ITS analysis we generated a new ITS-primer(ITS8) by a multiple alignment of five different genera and species of mycorrhizal fungi. The utilization of ITS1 and ITS8 resulted in specific PCR amplicons, which were characterized by sequencing without purification steps, even when the template DNA was associated with roots.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제10권2호
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• pp.264-266
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• 2000

A new GFP-based T-vector for cloning of PCR products was developed by using a green fluorescent protein (GFP) as a mafker. In order to facilitate the DNA inserts, multiple restriction sites, SP6 and T7 RNA polymerase promoter sites, were introduced close to the PCR DNA insertion site of a pCRGv vector. The XcmI-digested pHNT plasmid can be used to clone a 3' A-overhanged PCR DNA amplified by Taq DNA polymerase. A potential method of easing some difficulties from its use along with its cost savings proveded by this vector are likely to lead to the replacement of other T-vectors for PCR DNA cloning.

• 한국버섯학회지
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• 제11권2호
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• pp.69-76
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• 2013

우리나라와 전 세계의 여러 지역에서 수집한 비늘버섯속 18 균주와 개암비늘버섯 2 균주를 대상으로 rDNA의 ITS region 염기서열과 genomic DNA의 RAPD-PCR을 수행하였다. ITS1과 ITS2영역의 염기의 수는 각각 233~271, 158~233 그리고 174~219 염기쌍으로 종에 따라 변이가 있었는데 ITS2영역의 염기서열이 ITS1의 영역보다 변이가 높았고 5.8S지역의염기의수는 비교적 변이가 적었다. 각각의 균주 간 유연관계를 알아보기 위해 ITS영역의 염기서열을 이용하여 계통도를 작성한 결과 실험에 사용한 균주는 8개의 클러스터로 나누어지는 것으로 나타났으며 동일한 종의 버섯은 동일한 클러스터에 속하는 것으로 나타났다. 또한 20종류의 primer를 이용하여 비늘버섯속 버섯을 대상으로 RAPD-PCR을 수행한 결과 15개의 primer가 효과적으로 염색체 DNA를 증폭하는 것으로 나타났다. 증폭의 양상은 primer의 종류와 종에 따라 변이가 있었다. 이 결과를 토대로 계통수를 작성한 결과 계통수는 ITS 영역의 PCR 결과와 매우 유사하였다. 본 실험결과, 실험에 사용한 비늘버섯속 버섯의 종과 계통 간의 유연관계는 높았으며, rDNA ITS 영역의 염기서열분석 결과를 이용해 공시된 각각의 비늘버섯 종을 분류하는데 유용하게 사용이 가능하였다.

• 식물병연구
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• 제11권1호
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• pp.48-55
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• 2005

Cylindrocarpon destructans는 인삼 및 수목에 뿌리썩음병을 일으키는 토양 전염병 식물병원균이다. 신속 정확한 검출 가능성을 알아보기 위하여 종 특이적인 primer와 nested PCR 기법을 활용하여 인삼 유묘로부터 뿌리썩음 병균 C. destructans로 2차 PCR증폭을 실시한 결과 병원성이 확인된 C.destructans에서만 400bp의 종특이적 증폭산물을 얻을 수 있었다. 종 특이성 primer 와 nested PCR 기법을 이용한 인삼뿌리썩음병균 DNA에 대한 반응 민감도는 최저 약 1fg으로 나타나 단 몇 개의 포자만 존재해도 검출이 가능하였다. 또한, nested PCR 기법은 실제 이병토양에 심었을 경우에도 C.destructans 에 감염된 인삼 유묘로부터만 정확하게 병원균을 검출해 내었다. 종특이적 primer 와 nested PCR 기법을 이용한 본 연구 결과는 실제 재배농가에서 인삼 경작시 뿌리썩음병 진단에 매우 유용하게 활용될 수 있을 것으로 판단된다.

• 한국산림과학회지
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• 제96권5호
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• pp.585-590
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• 2007

Rhizina undulata is the fungus, which causes Rhizina root rot on coniferous trees. Nested-PCR using ITS-specific primer was applied to detect R. undulata from the soils of Japanese black pine (Pinus thunbergil) forests infested with the disease in Seocheon, Chungnam Province, South Korea. Soil samples were collected from four different sites, both dead trees and fruit bodies of R. undulata were present, dead trees only present, fruit bodies only present, and both were absent. Nested-PCR products specific to R. undulata ITS-region were amplified. Positive reactions were found in some samples from the sites, where dead trees and fruit bodies of R. undulata were absent as well as where both of those were present. R. undulata was mainly detected in the soil samples from the depth of 5~20 cm under the soil surface. These results show that the nested-PCR could be used to diagnose the presence or potential infestation of R. undulata in the soils of pine forests.

• 한국버섯학회지
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• 제7권4호
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• pp.150-155
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• 2009

최근들어 수입량이 급증되고 있는 차가버섯의 분류체계를 확립하고, 이들 종 및 계통간의 유연관계 확립과 품종 구분을 위해 계통학적 정보를 지닌 ITS 영역의 염기서열, PCR-RFLP 및 STS 프라이머를 사용하여 종 특이적인 마커를 개발하였다. 시베리아 캄차카 반도에서 수집된 74008 균주의 염기서열을 이용하여 Inonotus spp.의 유연관계를 분석한 결과 2개의 그룹으로 나뉘어 졌고, I. obliquus DSM 856P균주와 약 98%의 가장 높은 유사성을 나타내어 차가버섯임이 확인되었다. 또한 ITS 증폭산물을 제한효소로 처리하여 밴드 패턴을 비교하였을 때 종 및 계통에 따라 밴드가 다르게 나타났으며, STS primer를 이용하여 증폭산물을 비교하였을 때 종간에는 밴드패턴이 다르나 계통내에서는 동일한 밴드패턴을 보였다. 따라서 차가버섯의 품종 구분을 위해서는 STS 마커와 PCR-RFLP를 동시에 사용함으로서 품종 구분이 좀 더 명확하리라 사료된다.

• 한국자원식물학회지
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• 제17권2호
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• pp.82-93
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• 2004

국내에 자생하는 두릅나무과 식물의 형태적 분류를 재확인하고, 분자적 방법에 의해 속 및 종간 유연 관계를 파악해 보고자 PCR-RAPD 와 ITS sequence 분석을 실시하였다. 채집된 오갈피과 식물을 이용하여 PCR-RAPD를 실시한 결과 속과 종을 구분할 수 있는 다양한 polymorphic 밴드를 관찰할 수 있었다. 또한 실험에 이용한 두릅나무 개체군 내에서 다양한 쓱 변이가 있음을 확인할 수 있었고, 인삼에서는 재배종 내의 변이는 관찰되지 않았으나 야생종과 재배종간의 유전적 차이가 존재함을 확인할 수 있는 밴드들이 나타났다. ITS분석에서는 각각의 속과 종만이 지니는 특이 염기 서열이 나타나 ITS를 이용한 속과 종 분류가 가능하였다. ITS 염기서열로 작성한 계통수를 분석 한 결과 오갈피속은 음나무속과 근연임을 알 수 있었고, 두릅속과 인삼속이 하나의 계통이며 송악은 다른 속과 명료하게 구분됨을 확인하였다. 두릅속과 인삼속이 근연관계임은 RAPD 결과에서도 확인되었다. 인삼은 RAPD 분석 결과 재배종과 야생종 사이에 변이가 존재함이 관찰되었으나, ITS 분석 결과에서는 야생종과 재배종간의 변이를 관찰 할 수 있는 결과가 나타나지 않았다. 또한 RAPD와 ITS 분석 결과 모두 지역에 따른 재배종 인삼의 유전적 차이도 관찰되지 않았다. 이를 통해 국내에서 재배중인 인삼이 단계통임을 알 수 있었다. ITS 분석에서는 속과 종 수준의 분류가 가능한 특이 염기 서열들이 관찰되었다.

• 생명과학회지
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• 제14권1호
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• pp.32-37
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• 2004

ITS2 부위를 시퀀싱하여 Pseudo-nitzschia delcatissima, P. multiseries, P. pungens, P. subfraudulenta 상호간의 유전자 다양도를 조사함과 아울러 RAPD-PCR pattern을 이용하여 유사도를 구하였다. 유전자 거리를 근거로 했을 때 P. delicatissima 종은 P. multiseries와 P. pungens와는 유전적 거리가 상당히 요원하였고, 심지어 P. subfraudenlta와도 거리를 보였다. 유사도의 경 P. multiseries와 P. pungens는 0.31로 보인 반면에, P delicatissima는 다른 세종과 0.81를 나타내었다. 따라서 P. delicatissima 종은 P. multiseries, P. pungens, P. subfraudulenta와는 유전적으로 밀접하지 않는 관계로 보였다. ITS2부위는 Pseudo-nitzschia 동정에 사용될 수 있는 유용한 도구로 보이며 형태적으로 구분할 수 없는 P. multiseries와 P. pungens을 구분할 수 있다. 또한 RAPD-PCR 방법도 단시간에 Pseudo-nitzchia을 분리시키는데 사용될 것으로 보인다.

• Parasites, Hosts and Diseases
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• 제55권6호
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• pp.601-606
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• 2017

Cystoisospora is responsible for morbidity in immunocompromised patients. PCR is sensitive for diagnosing Cystoisospora; however, it needs reevaluation for differential molecular diagnosis of cystoisosporiasis. We aimed at evaluating melting curve analysis (MCA) after real-time PCR (qPCR) in diagnosis and genotyping of Cystoisospora as an alternative to conventional PCR. We included 293 diarrheic stool samples of patients attending the Department of Clinical Oncology and Nuclear Medicine of Cairo University Hospitals, Egypt. Samples were subjected to microscopy, nested PCR (nPCR), and qPCR targeting the internal transcribed spacer 2 region (ITS2) of the ribosomal RNA (r RNA) gene followed by melting temperatures ($T_ms$) analysis and comparing the results to PCR-RFLP banding patterns. Using microscopy and ITS2-nPCR, 3.1% and 5.8% of cases were Cystoisospora positive, respectively, while 10.9% were positive using qPCR. Genotyping of Cystoisospora by qPCR-MCA revealed 2 genotypes. These genotypes matched with 2 distinct melting peaks with specified $T_ms$ at $85.8^{\circ}C$ and $88.6^{\circ}C$, which indicated genetic variation among Cystoisospora isolates in Egypt. Genotype II proved to be more prevalent (65.6%). HIV-related Kaposi sarcoma and leukemic patients harbored both genotypes with a tendency to genotype II. Genotype I was more prevalent in lymphomas and mammary gland tumors while colorectal and hepatocellular tumors harbored genotype II suggesting that this genotype might be responsible for the development of cystoisosporiasis in immunocompromised patients. Direct reliable identification and differentiation of Cystoisospora species could be established using $qPCR-T_ms$ analysis which is useful for rapid detection and screening of Cystoisospora genotypes principally in high risk groups.

• 대한의생명과학회지
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• 제14권2호
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• pp.115-118
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• 2008

Salmonella typhi is frequent causes of foodborne illness and its detection is important for monitoring disease progression. In this study, by using general PCR and novel LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification) assay, we evaluated the usefulness of LAMP assay for detection of Salmonella typhi. In this LAMP assay, forward inner primer (FIP) and back inner primer (BIP) was specially designed for recognizing target invA gene. Target DNA was amplified and visualized as ladder-like pattern of bands on agarose gel within 60 min under isothermal conditions at $65^{\circ}C$. When the sensitivity and reproducibility of LAMP were compared to general PCR, there was no difference of reproducibility but sensitivity of LAMP assay was more efficient than PCR (the detection limit of LAMP assay was 30 fg, while the PCR assay was 3 pg). These results indicate that the LAMP assay is a potential and valuable means for detection of Salmonella typhi, especially for its rapidity, simplicity and low cost.