• 한국식품위생안전성학회지
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• 제6권3호
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• pp.111-117
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• 1991

가축사료중 zearalenone 분석을 위한 enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) 법의 개발을 위해 우선 zearalenone의 항원성을 증폭시키기 위해 zearalenone oxime 유도체를 합성한 다음 bovine serum albumin(BSA)와 conjugate를 만들고, 이를 항원으로 토끼에 면역시켜 11주에 zearalenone에 특이한 항체를 얻어냈다. 생성된 항체를 zearalenone외에 ${\alpha}-zearalenol$과는 강한 cross reactivity를 나타내었고 ${\beta}-zearalenol,\;{\alpha}-zearalenol\;및\;{\beta}-zearalenol$과는 약간의 반응을 보였으며 확립된 ELISA 조건은 당므과 같다. 먼저 시료를 methanol-phosphate buffered saline-dimethyl formate(70 : 29: 1)을 4배 첨가하여 blending 한 다음 Whatman No. 4를 통한 여액을 ELISA시료로 사용하였다. 효소 반응시간과 발색시간은 각각 $37^{\circ}C$에서 30분과 15분이었고, 흡광도는 410nm에서 ELISA reader로서 측정하였으며, 측정한계는 1~100 ppb로 매우 낮았다. 확립된 ELISA 조건으로 실제시료의 zearalenone오염도는 측정결과 24개 시료 중 4개의 시료가 양성반응을 보였고 그 함량범위는 $3.93~7.43\;\mu\textrm{g}/kg$이었다.

• Biomaterials and Biomechanics in Bioengineering
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• 제2권1호
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• pp.23-32
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• 2015

Facile immobilization of growth factors in hyaluronic acid (HA) hydrogels using dual enzymes is reported in the paper. The hydrogels were formed by using horseradish peroxidase (HRP) and hydrogen peroxide ($H_2O_2$) and transforming growth factor-${\beta}3$ (TGF-${\beta}3$) was covalently conjugated on the hydrogels in situ using tyrosinase (Ty) without any modifications. For the preparation of hydrogels, HA was grafted with poly(ethylene glycol) (PEG), which was modified with a tyrosine. The gelation times of the HA hydrogels were ranging from 415 to 17 s and the storage moduli was dependent on the concentration of $H_2O_2$ and Ty (470-1600 Pa). A native TGF-${\beta}3$ (200 ng/mL) was readily encapsulated in the HA hydrogels and 17% of the TGF-${\beta}3$ was released over 1 month at the Ty concentration of 0.5 KU/mL, while the release was faster when 0.3 KU/mL of Ty was used for the encapsulation (27%). It can be suggested that the growth factors resident in the hydrogels for a long period of time may lead cells proliferating and differentiating, whereas the growth factors that are initially released from the hydrogels can induce the ingrowth of cells into the matrices. Therefore, the dual enzymatic methods as facile gel forming and loading of various native growth factors or therapeutic proteins could be highly promising for tissue regenerative medicines.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제31권4호
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• pp.501-509
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• 2021

More than half the world's population is thought to be infected with Helicobacter pylori. Although the majority of infected people are asymptomatic, H. pylori infection may cause gastric ulcers and deadly gastric cancer. Owing to the difficulty and invasiveness of current routine culture and diagnostic methods, a highly sensitive and specific noninvasive assay for H. pylori is of interest. This study highlighted the design and performance of a colorimetric magneto loop-mediated isothermal amplification (CM-LAMP) assay to detect H. pylori in spiked saliva samples. LF primers were coated on magnetic nanoparticles by carbodiimide-induced immobilization and functionally used for solid-phase amplification. During the LAMP reaction at 66℃, biotin-tagged FIPs were incorporated into LAMP amplicons. The colorimetric signal developed after the addition of NeutrAvidin horseradish peroxidase conjugate (NA-HRP) and ABTS. None of the tested microorganisms, including closely related bacteria, was shown positive by the CM-LAMP assay except H. pylori isolates. This novel platform was highly specific and 100-fold more sensitive (40 CFU/ml or 0.2 CFU per reaction) than the PCR and conventional LAMP assays for the detection of H. pylori in spiked saliva. Our results demonstrated the feasibility of using this noninvasive molecular diagnostic test to detect H. pylori in saliva samples.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제31권5호
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• pp.705-709
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• 2021

Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) is a major bacterial pathogen that causes periodontitis, a chronic inflammatory disease of tissues around the teeth. Periodontitis is known to be related to other diseases, such as oral cancer, Alzheimer's disease, and rheumatism. Thus, a precise and sensitive test to detect P. gingivalis is necessary for the early diagnosis of periodontitis. The objective of this study was to optimize a rapid visual detection system for P. gingivalis. First, we performed a visual membrane immunoassay using 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB; blue) and coating and detection antibodies that could bind to the host laboratory strain, ATCC 33277. Antibodies against the P. gingivalis surface adhesion molecules RgpB (arginine proteinase) and Kgp (lysine proteinase) were determined to be the most specific coating and detection antibodies, respectively. Using these two selected antibodies, the streptavidin-horseradish peroxidase (HRP) reaction was performed using a nitrocellulose membrane and visualized with a detection range of 10³-10⁵ bacterial cells/ml following incubation for 15 min. These selected conditions were applied to test other oral bacteria, and the results showed that P. gingivalis could be detected without cross-reactivity to other bacteria, including Streptococcus mutans and Escherichia fergusonii. Furthermore, three clinical strains of P. gingivalis, KCOM 2880, KCOM 2803, and KCOM 3190, were also recognized using this optimized enzyme immunoassay (EIA) system. To conclude, we established optimized conditions for P. gingivalis detection with specificity, accuracy, and sensitivity. These results could be utilized to manufacture economical and rapid detection kits for P. gingivalis.

• 미생물학회지
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• 제52권1호
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• pp.10-17
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• 2016

항체의 특이적 결합을 분석하는 효소면역분석법은 항원의 탐지를 위해 주로 horseradish peroxidase (HRP) 또는 alkaline phosphatase (AP) 등의 효소를 사용한다. 이때 효소를 주로 화학적으로 항체에 결합시켜 사용하게 되는데 이 과정이 복잡하며 불규칙하게 일어나서 항체 및 효소의 기능을 감소시키게 된다. 또한 대부분의 효소면역분석법에서는 주로 일차 항체의 항원결합을 탐지하기위해 이차 항체를 사용하는데, 즉 이차 항체에 결합한 효소의 기질발색에 의해 일차 항체의 항원결합을 탐지하므로 이차 항체가 요구 되어질 뿐만 아니라 이차 항체의 일차 항체에 대한 반응을 위한 부가적인 배양시간이 필요하다. 더욱 더 중요한 것은 이차 항체만의 비특이적 항원 결합 역시 제거되어져야 한다. 본 연구에서는 대장균의 genomic DNA로부터 PCR을 통해 alkaline phosphatase 유전자(Sadeghi et al., 2008)를 증폭 분리한 다음 이를 TRAIL (tumor necrosis factor ${\alpha}$ related apoptosis induced ligand) receptor인 death receptor 4 (DR4)에 특이적으로 결합하는 hAY4 single-chain Fv (ScFv)에 융합시킨 재조합 ScFv-AP 형태로 대장균에서 발현시켜 정제하였다. 정제된 hAY4 ScFv-AP는 SDS-PAGE에서 단량체(monomer) 분자량인 73.8 kDa을 나타내었다. 그러나 size-exclusion chromatography(SEC)에서는 147.6 kDa을 나타내는 결과를 통해 hAY4 ScFv-AP는 AP의 자연적인 비공유결합에 의해 이량체(dimeric form)형성이 유도되어짐을 확인하였다. 또한 ELISA, Western blot 그리고 immunocytochemistry에서 이차 항체 없이 일차 항체 hAY4 ScFv에 직접 융합된 AP의 기질발색에 의해 ScFv 일차 항체의 특이적 항원결합을 나타내었다. 요약하면 hAY4 ScFv와 대장균의 alkaline phosphatase 유전자를 융합시켜 대장균에서 수용성 형태로 성공적으로 정제하였으며 정제된 ScFv-AP 융합단백질은 ELISA, Western blot 및 immunocytochemistry에서 항원결합력을 나타냈으며 또한 구매에 따른 고비용, 부가적인 배양시간 및 비특이적 결합에 의한 오류 등의 문제점을 갖는 이차 항체를 사용하지 않고 직접적인 항원결합력을 나타내었다.

• 한국식품과학회지
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• 제36권6호
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• pp.959-967
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• 2004

인간의 대장내 점막에 대하여 우수한 점착특성을 갖는 probiotic 유산균주를 선별할 목적으로, colonic mucin-binding assay를 고안하고 최적의 분석 조건을 검토한 결과, microtiter plate의 well에 대한 colonic mucin의 부착은 pH 4.8, biotinylated SLP의 농도는 $5.0\;{\mu}g/mL$, 시판 HRP-conjugated streptoavidin은 24,000배 희석용액, TMB의 발색시간은 10분의 조건에서 측정시 최적의 결과를 나타냈다. 동 조건에서 본 assay system을 이용할 경우, 장내 점착능 측정 및 우수 유산균주의 선별에 있어 신속하고 재현성 있는 결과를 제공할 수 있으며, 인간의 대장에 대한 유산균의 점착특성을 정량적으로 분석할 수 있음을 보여주었다. 공시균주 32종 및 유아 분변 유래의 분리균주 18종을 포함한 총 50종의 유산균주에 대하여, colonic mucin-binding assay를 이용하여 대장 mucin에 대한 결합능을 비교한 결과, L. species FSB-1이 가장 높은 결합능을 보여주었다. 따라서 L. species FSB-1을 대상으로 형태학적 특성, 생리 및 생화학적 특성과 16S rDNA에 대한 부분 염기서열 분석을 포함한 동정실험을 수행한 결과, 장내 점착능 우수균주로 선별된 L. species FSB-1은 Lactobacillus brevis로 최종 동정되었다.

• Applied Microscopy
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• 제38권4호
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• pp.375-382
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• 2008

삼차신경주감각핵에서 치수유래 일차들신경섬유의 종말과 그에 연접하는 연접이전신경종말에 함유된 연접소포들을 형태학적으로 비교하기 위하여 신경추적자(WGA-HRP)를 흰쥐 앞니의 치수강에 주입하여 치수 유래 일차들신경종말을 표식한 후, 투과형 전자현미경을 통한 미세구조적 정량 분석을 실시하였다. 표식된 치수유래 일차들신경종말은 직경이 $45{\sim}55\;nm$인 구형의 소포를 함유하고 있었으며, 일부 직경이 $80{\sim}120\;nm$ 큰 치밀소포가 관찰되기도 하였다. 또한 표식된 신경종말은 다형성 연접소포를 함유하고 있는 연접이전신경종말과 대칭연접을 이루고 있었다. 일차들신경종말의 연접소포들은 긴 지름에 대한 짧은 지름의 비율(form factor)이 $0.6{\sim}0.99$의 분포를 보인 반면, 연접이 전신경종말의 연접소포들은 $0.25{\sim}0.99$까지 다양하게 나타났다. 또한 대부분의 연접이전신경종말은 GABA에 대한 면역양성반응을 보였다. 이상의 결과는 표식된 신경종말과 그에 연접하는 연접이전신경종말의 연접소포는 서로 다른 형태를 보이고 있으며, 또한 그 연접이전신경종말이 억제성 신경전달물질인 GABA를 함유하고 있음을 나타낸다.

• 한국식품과학회지
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• 제35권3호
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• pp.366-372
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• 2003

유전자재조합 콩의 Agrobacterium sp. CP4 유래 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase(CP4 EPSPS)를 편리하고 경제적으로 검출하고자 효소면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)을 개발하였다. CP4 EPSPS에 대해 특이적인 다클론 및 단클론항체를 생산하였다. 다클론 항체의 경우 sandwich ELISA(검출한계, 0.03${\mu}g/mL$)는 competitive indirect ELISA(1${\mu}/mLg$)보다 CP4 EPSPS의 검출감도가 낮았다. 생산된 단클론항체 3종의 CP4 EPSPS에 대한 인식부위는 Mab1과 Mab2는 서로 같은 부위를 Mab3는 다른 부위를 인식하는 것으로 나타났다. 한편, 다클론항체 및 단클론항체를 조합하여 실시한 sandwich ELISA의 검출감도를 서로 비교하였다. 그 결과, 항원 포획단계에서 단클론항체 Mab2를 코팅하고 다클론항체-horseradish peroxidase(HRP) conjugate를 사용하였을 때 가장 양호한 검출감도(검출한계, 0.02${\mu}g/mL$)를 나타내었다. 본 연구에서 개발한 sandwich ELISA는 제초제 저항성 유전자재조합 콩의 분석에 적용가능할 것으로 생각된다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제4권1호
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• pp.115-123
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• 2000

남성 및 여성의 타액내 testosterone의 농도를 측정하기 위하여 초감도 효소면역측정법 (ultrasensitive enzymeim-munoassay; EIA)을 정립하고, 이 EIA를 이용하여 한국인 정상 여성 및 남성의 타액에서 testosterone의 정상농도를 얻고자 하였다. 정상 월경주기를 가진 여성 18명에서 아침 6～9시 사이에 타액을 채취하였고, 남성의 타액도 오전 (9～10시)중에 채취하였다. EIA의 표지물질로는 horseradish peroxidase를 사용하였고, 기질은 ABTS [2,2'-azino-di(3-ethyl-benzthiazoline sulphonic acid)]를 사용하였다. 항원 항체 결합형과 비결합형의 분리를 용이하게 하기 위해 항혈청을 microcrystalline cellulose 에 mixed anhydrohydride 방법을 이용하여 부착시켜 사용하였다. 항원항체 결합 후 기질을 첨가하여 반응을 시키고 발색시켜 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 본 EIA의 특성을 방사면역측정법 (RIA)과 비교하여 평가하였다. 본 실험에서 정립된 EIA의 감도 (sensitivity)는 약 25 pg/tube 이하이었고, 표준시료를 첨가해 측정치와 기대치를 비교한 정확도(accuracy)는 측정치 (Y) = 0.96 X 기대치 (X) - 0.89이었고 상관계수 (r)는 0.985이었다. 본 실험에서 생산하여 사용한 항체의 역가는 1/56,000이었고, 항체의 교차반응(cross-reaction)을 다른 8종의 steroid를 이용하여 조사한 결과 5 $\alpha$-dihydrotestosterone (DHT)와 52%로 나타났으나 다른 steroids와는 0.1% 이내의 교차반응도를 나타내었다. 정밀도 (precision)는 intra-assay variation 과 inter-assay variation의 변이계수 (coeffcient of variation)가 10% 내외로 만족할 만한 범위에 들었다. 본 실험 방법을 타액과 혈청내 testosterone 농도 측정에 응용하여 RIA의 결과와 비교하여 본 바 상관관계가 타액에서 r=0.969, 혈청에서 r=0.990으로 두 결과가 잘 일치하였다. 본 실험에서 측정된 한국인 여성의 타액내 testosterone농도는 107.7$\pm$12.0 pmol／l이었고, 남성의 타액내 농도는 274.2$\pm$22.1 pmol／l이었다. 이상의 결과로 보아 본 연구에서 정립된 EIA 방법은 RIA를 대신하여 소규모의 실험실에서도 활용할 수 있을 것으로 사려된다.

• Maxillofacial Plastic and Reconstructive Surgery
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• 제15권4호
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• pp.281-301
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• 1993

단일축삭내 HRP 주입기법에 의해 서순응형 치근막 기계적자극수용기에서 오는 일차구심성 신경섬유증 무수축삭에 의해 연결되어 있는 종말지의 시냅양상 및 미세구조에 대한 연구결과는 다음과 같았다. 1. 표식된 stem collateral은 첫 bouton을 형성할 때까지는 수질을 함유하고 있었으며, 그 직경은 약 $0.81-1.38{\mu}m$이었고, 각 terminal bouton은 특징적으로 모두가 무수축삭에 의해 연결되어 있었다. 2. 대부분의 표식 bouton은 dome형태를 나타내었으며, 때때로 길쭉한 모양 혹은 둥근모양의 bouton도 다소 관찰되었으나 scalloped 형태 혹은 glomerulus 형태의 bouton은 전혀 나타나지 않았으며 각 표식 bouton은 균일한 형태 및 크기(직경 $47.60{\pm}3.58{\mu}m$)를 가진 밝은 타원 및 원형의 소포들을 함유하고 있었다. 3. 표식 bouton은 평균직경 $1.15{\pm}0.24{\mu}m$로서 비교적 작았고 평균 $1.11{\pm}0.31$개의 다른 neuronal propile과 시냅스를 이루었는데 그중 단 1개의 neuronal propile과 시냅스를 이루는 것이 89.4%, 2개의 neuronal propile과 시냅스를 이루는 것이 10.6%로서 대단히 단순한 형태의 시냅스를 이루는 것이 특징적으로 나타났으며, 그중 대부분(80.03%)이 dendritic shaft 혹은 spine과만 시냅스를 이루었으며 p-ending과 시냅스를 이루는 것은 6.1%였고 synaptic triad는 전혀 관찰되지 않았다.