• The Plant Pathology Journal
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• 제24권1호
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• pp.1-7
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• 2008

Fusarium verticillioides (teleomorph Gibberella moniliformis) is associated with maize worldwide causing ear rot and stalk rot, and produces fumonisins, a group of mycotoxins detrimental to humans and animals. While research tools are available, our understanding of the molecular mechanisms associated with fungal virulence and fumonisin biosynthesis in F. verticillioides is still limited. One of the restraints that hampers F. verticillioides gene characterization is the fact that homologous recombination (HR) frequency is very low (<2%). Screening for a true gene knock-out mutant is a laborious process due to a high number of ectopic integrations. In this study, we generated a F. verticillioides mutant (SF41) deleted for FvKU70, a gene directly responsible for non-homologous end-joining mechanism, with the aim of improving HR frequency. Here, we demonstrate that FvKU70 deletion does not impact key Fverticillioides phenotypes, e.g., development, secondary metabolism, and virulence, while dramatically improving HR frequency. Significantly, we also confirmed that a high percentage (>85%) of the HR mutant strains harbor a desired mutation with no additional copy of the mutant allele inserted in the genome. We conclude that SF41 is suitable for use as a type strain when performing high-throughput gene function studies in F. verticillioides.

• Preventive Nutrition and Food Science
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• 제8권4호
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• pp.390-394
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• 2003

In the post-genome period, the technique for identifying gene expression has been progressed to high throughput screening. In the field of molecular nutrition, the use of screening techniques to clarify molecular function of specific nutrients would be very advantageous. In this study, we have evaluated Zn-regulated gene expression in Zn-deficient, homocystein-treated EA.hy926 cells, using cDNA microarray, which can be used to screen the expression of many genes simultaneously. The information obtained can be used for preliminary assessment of molecular and signaling events modulated by Zn under pro-atherogenic conditions. EA.hy926 cells derived from human umbilical vein endothelial cells were cultured in Zn-adequate (control, 15 $\mu$M Zn) or Zn-deficient (experimental, 0 $\mu$M Zn) Dulbecco's MEM media under high homocysteine level (100 $\mu$M) for 3 days of post-confluency. Cells were harvested and RNA was extracted. Total RNA was reverse-transcribed and the synthesized cDNA was labeled with Cy3 or Cy5. Fluorescent labeled cDNA probe was applied to microarray slides for hybridization, and the slide was then scanned using a fluorescence scanner. The expression of seven genes was found to be significantly decreased, and one significantly increased, in response to treatment of EA.hy926 cells with Zn-deficient medium, compared with Zn-supplemented medium. The upregulated genes were oncogenes and tumor suppressor genes, cell cycle-related genes and transporter genes. The down-regulated gene was RelB, a component of the NF-kappaB complex of transcription factors. The results of this study imply the effectiveness of cDNA microarray for expression profiling of a singly nutrient deficiency, namely Zn. Furthur study, using tailored-cDNA array and vascular endothelial cell lines, would be beneficial to clarify the molecular function of Zn in atherosclerosis, more in detail.

• 미생물학회지
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• 제47권1호
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• pp.14-21
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• 2011

리보플라빈 생성효소(riboflavin synthase)는 기질인 두 분자의 6,7-dimetyl-8-ribityllumazine과 결합 후, 4-탄소 단위(4-carbon unit)의 자리 옮김 반응을 거쳐 한 분자의 리보플라빈과 한 분자의 pyrimidine 유도체를 형성하는 반응을 촉매한다. 대장균(Escherichia coli) 리보플라빈 생성효소의 아미노-말단 도메인 절반(N-terminal domain half)과 카복시-말단 도메인 절반(C-terminal domain half)은 매우 유사한 내부 자체 아미노산 서열(intra-molecular amino acid sequence)을 갖는다. 아미노-말단 영역 리보플라빈 생성효소(N-RS) 단백질의 구조와 형광 특성을 알아보기 위하여 중합효소 연쇄 반응과 위치지정 돌연변이를 통하여 10개 이상의 돌연변이 아미노-말단 리보플라빈 생성효소 단백질을 코드 하는 유전자를 증폭시켜 pQE30 벡터에 삽입한 재조합 플라스미드를 제조하여, 과발현시킨 후 분리 정제하였다. 대부분의 아미노-말단 도메인 리보플라빈 생성효소의 돌연변이 단백질들은 야생형과 같이 형광성 리간드인 6,7-dimetyl-8-ribityllumazine 혹은 리보플라빈과 결합할 수 있는 능력을 지니고 있었으나, N-RS C47D, N-RS ET66,67DQ 돌연변이 단백질의 경우는 리간드와의 결합능력이 현저히 떨어져 형광을 띠지 않았다. 대부분의 돌연변이 단백질들의 형광 세기는 야생형 단백질(N-RS wt)보다 낮았으나, N-RS C48S는 예외적으로 야생형 단백질에 비해 2배 이상의 형광세기를 가졌다. 이와 같은 결과를 바탕으로 리보플라빈 생성효소와 형광성 리간드 사이의 상호작용을 예측 할 수 있으며, N-RS C48S 돌연변이 단백질의 형광성을 활용하여 효과적으로 효소 저해제를 발굴할 수 있는 고속다중 스크리닝 법(high-throughput screening system)으로써 활용될 수 있을 것이다.

• 농약과학회지
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• 제7권2호
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• pp.92-99
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• 2003

96-well plate를 사용해서 DPPH free radical 소거활성의 고효율검정 (high throughput screening)방법을 확립하였고, 이 방법을 이용하여 107개의 식물특정 효소저해제와 다양한 식물 추출물의 항산화활성을 조사하였다. DPPH free radical 소거활성 측정 측정을 위한 적정 시험조건은 총 반응액이 $250{\mu}L$일 경우 $100{\mu}M$의 DPPH(pH 7.8), 20 분의 반응시간이었고, 이 조건하에서 ascorbate와 a-tocopherol 은 농도 의존적인 항산화활성을 나타내었다. 107개의 식물 특정효소저해제 중에서 11개의 화학물질이 $100{\mu}M$ 농도에서 70% 이상의 항산화활성이 있었는데, 특히 ampicillin과 gallic acid는 각각 90.2% 와 92.6% 의 나타냈다. 또한 100개의 식물 추출물은 $50{\mu}g/mL$ 농도에서 70% 이상의 활성을 보이는 추출물이 11개이었는데, 그 중에서 AT-407의 활성이 90.1%로 가장 높게 나타났다. 따라서 96-well plate를 이용한 DPPH free ra 이때 소거활성 측정방법은 여러가지 합성물질이나 다양한 천연물질에 대하여 보다 간편하고 신속하게 항산화활성을 측정할 수 있을 것으로 사료되었다.

• Toxicological Research
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• 제22권1호
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• pp.15-22
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• 2006

Many of endocrine disrupting chemicals induce effects via interaction with hormone receptors and responsive elements in target cells. We investigated endocrine disrupting effects of some food additives and contaminants including BHA, BHT, ethoxyquin, propionic acid, sorbic acid, benzoic acid, CPM, aflatoxin B1, cadmium chloride, genistein, TCDD and PCBs in yeast transformants expressing human steroid hormone receptors along with steroid responsive elements. The response limit of genetically recombinant yeast to $17{\beta}$-estradiol, testosterone and progesterone was $1{\times}10^{-16},\;1{\times}10^{-12}\;and\;1{\times}10^{-13}M$, respectively. BHT induced weak transcriptional activity in estrogen sensitive yeast, while BHA and sorbic acid interacted weakly with androgen receptor/responsive element. CPM induced transcriptional activities in all types of yeasts sensitive to steroid hormones. Zearalenone and genistein induced high transcriptional activation in estrogen sensitive yeast with relative potencies almost $10^8$ folds lower than $17{\beta}$-estradiol. TCDD induced transcriptional activation weakly in estrogen- and progesterone- sensitive yeasts. This study elucidated that recombinant yeast is a sensitive and high-throughput system and can be used for the direct assessment on chemical interactions with steroid receptors and responsive elements. Also, the present study raises the requirement of evaluation on the endocrine disrupting effects of BHT, BHA, sorbic acid, CPM and TCDD for their transcription activity in yeast screening system though weak in intensity.

• Journal of Genetic Medicine
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• 제18권1호
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• pp.31-37
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• 2021

Purpose: To summarize the results of chromosomal microarray analysis (CMA) for copy number variants (CNVs) detection and clinical utility in a single tertiary hospital. Materials and Methods: We performed CMA in 46 patients over the course of two years. Detected CNVs were classified into five categories according to the American College of Medical Genetics and Genomics guidelines and correlated with clinical manifestations. Results: A total of 31 CNVs were detected in 19 patients, with a median CNV number per patient of two CNVs. Among these, 16 CNVs were classified as pathogenic (n=3) or likely pathogenic (LP) (n=11) or variant of uncertain significance (n=4). The 16p11.2 deletion and 16p13.11 deletion classified as LP were most often detected in 6.5% (3/46), retrospectively. CMA diagnostic yield was 24.3% (9/37 patients) for symptomatic patients. The CNVs results of the commercial newborn screening test using next generation sequencing platforms showed high concordance with CMA results. Conclusion: CMA seems useful as a first-tier test for developmental delay with or without congenital anomalies. However, the classification and interpretation of CMA still remained a challenge. Further research is needed for evidence-based interpretation.

• Journal of Digestive Cancer Research
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• 제10권2호
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• pp.82-91
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• 2022

Gastrointestinal cancer accounts for one-third of the overall cancer occurrence worldwide. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is a type of gastrointestinal cancer that is known to be one of the most fatal among all cancer types, with a 5-year survival rate of less than 8%. Chemotherapy combined with surgical resection is its probable curative option. However, surgery is accessible for only 10-15% of patients diagnosed with PDAC. Organoids show self-organizing capacities and resemble the original tissue in terms of morphology and function. Organoids can also be cultured with high effectiveness from tumor tissues derived from each patient, making them an extremely fitting model for translational uses and improving personalized cancer medicine. Enhancing drug screening platforms is necessary to apply personalized medicinebased organoids in clinical settings.

• 대한세포병리학회지
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• 제18권1호
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• pp.1-12
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• 2007

Approximately 70% of cervical cancers are caused by HPV types 16/18 and thus the implementation of vaccination programmes with vaccines against HPV types 16/18 will have a major impact on the incidence of cervical cancer worldwide. However, this reduction will not be seen until several decades after full implementation of such vaccination programmes since the vaccines must be given to young adolescents before exposure to the virus and women who are already sexually active are not likely to be protected. Both GSK and Merck insist that even vaccinated women must continue to participate in regular cervical screening by the most sensitive method available since the vaccine can only give protection against up to 70% of cervical cancers. It is unlikely that the current vaccines will be modified to include additional high risk HPV types in the foreseeable future. While HPV testing is highly sensitive, it is not recommended for women under 30 years of age nor for vaccinated women. Additionally, HPV testing has poor specificity. The Digene Hybrid Capture 2 test is licensed for use only in conjunction with a cytology test, not as a stand-alone test, and the high risk panel has recognised cross reactivity with low risk HPV types. None of the other HPV test methods currently commercially available are FDA approved and all must be internally validated before use. This makes comparison of test results between laboratories difficult. The most sensitive and specific screening test currently available for women of all ages is the Cytyc ThinPrep System consisting of the ThinPrep Pap Test (TPPT) and the ThinPrep Imaging System (Imager). The TPPT was the first LBC system approved by the US FDA in 1996 and there are about 4,000 processors in use worldwide. The Imager was FDA approved in 2003 and over 350 systems are in routine use, mainly in the US. 40% of TPPT in the US are processed on Imager. There is clear evidence in peer reviewed literature that the Imager increases laboratory productivity by 100% and growing evidence that Imager detects more high grade SIL than the conventional smear or manual evaluation of TPPT. This aspect is particularly important since the number of cytological abnormalities will decrease as vaccination programmes are implemented. Cytotechnologists will see fewer and fewer abnormal smears and their skills will be put at risk. By doubling throughput, Imager will allow cytotechnologists to maintain their skills.

• Weed & Turfgrass Science
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• 제4권4호
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• pp.308-314
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• 2015

본 연구는 식물세포막을 파괴시켜 제초활성을 나타내게 하는 화합물(막과산화형 제초제)을 미지의 많은 화합물로부터 신속하게 탐색하기 위한 새로운 검정법을 확립하기 위하여 실시되었으며, 확립한 전체적인 검정과정은 다음과 같다. 96-well microplate에 시험용액 $200{\mu}L$ 넣고 여기에 오이자엽으로부터 적출한 직경 4 mm의 절편 1개씩을 띄운다. 항온실의 광조건 하에서 회전진탕기로 조금씩 흔들어주면서 8시간 배양한 후 절편을 제거한 다음, 배양액에 HVA와 HRP를 첨가하여 반응시킨 후 마이크로평판용 형광검출기를 이용하여 형광도(Ex 320 nm, Em 425 nm)를 측정한다. 형광변화량이 높을수록 제초활성이 높은 것으로 판단한다. 본 방법은 96-well microplate에서 작업을 수행할 수 있고 형광검출 기술을 이용함으로써 검정과정과 작업을 간편하게 하여 검정효율을 기존보다 현저히 높인 것이 특징이다. 아울러 활성검정을 추출된 효소가 아닌 잎 절편수준에서 수행하기 때문에 보다 실용화에 근접한 정량적 데이터를 얻을 수 있는 장점을 가진다.

• KSBB Journal
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• 제22권5호
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• pp.297-304
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• 2007

Lovastatin은 근사형성 균류인 Aspergillus terreus가 생합성하는 이차대사산물로 강력한 고지혈증 치료제로 널리 이용되는 물질이다. 본 연구에서는 lovastatin 고생산변이주를 이용하여 포자배지 최적화를 통한 miniature 배양 방법을 확립하고자 하였다. 우선 miniature 배양에 필수적인 효과적인 포자 형성 방법을 개발하고자 포자 형성 배지의 통계학적 배지 최적화를 수행하였다. Miniature 배양의 inoculum으로 이용되는 대량의 포자를 획득하기 위해 Plackett-Burman 실험법을 이용하여 포자 형성을 향상시키는 성분을 조사한 결과, glucose, sucrose, yeast extract 그리고 $KH_2PO_4$가 주목할 만한 효과를 보였다. 상기 성분의 최적 농도를 확인하기 위해 반응표면분석법 (RSM)을 이용한 결과, PDA 포자 형성 배지와 비교하여 볼 때, 최적 성분 농도에서 포자 형성이 약 190배 증가하였다. 최적화된 포자형성 배지를 이용하여 lovastatin 고생산성 변이주의 대량 선별을 위한 miniature 배양 방법을 확립하기 위해 기존의 실험 과정에 'PaB (adaptation)'라는 한 번의 계대배양을 더 추가한 결과 생산균주의 안정성과 재현성이 큰 폭으로 증가하는 주목할 만한 결과를 얻을 수 있었다. 단기간에 가능한 한 다량의 균주를 스크리닝하기 위해 성장배양과 생산배양 모두 조업부피가 7 ml인 tube를 이용해 miniature 배양을 반복 수행하여, lovastatin 생산성과 배양형태가 훌륭한 변이주를 선별할 수 있었는데, 이 균주는 7 ml tube배양과 250 ml flask배양 (조업부피 50 ml) 모두에서 생산성이 높은 것으로 보아 산소 의존도가 비교적 낮고 생산 안정성이 높은 균주인 것으로 판단되었다. 한편 miniature 배양을 이용해서 lovastatin 고생산성을 보이는 균주를 신속 선별하기 위해서는 균주의 적절한 배양형태 유도가 매우 중요한 것으로 관찰되었다. 즉 생산배양으로의 고활성 균주의 접종을 위해서, 또한 생산배양에서 pellet의 배양형태 유도를 위해서 성장배양 시에는 반드시 고농도의 균사모양을, 생산배양 시에는 직경 1 mm 이하의 pellet모양의 배양 형태를 유지해야만, 생산균주가 lovastatin을 안정적으로 고생산할 수 있는 것으로 관찰되었다. 초기에 선별된 균주를 이용하여 miniature 배양에 의해 고속 균주선별 실험을 반복함으로써 고생산성 균주들을 다량 선별할 수 있었는데, 이들의 lovastatin 생산성을 조사한 결과, 기존의 flask 배양대비 오차범위가 $\pm$20% 이내의 생산성을 보이는 균주가 초기 선별시의 32%에 비해 81%로 크게 증가함을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는 lovastatin 고생산성, 고안정성 균주의 고속 스크리닝을 위해서 본 연구에서 개발한 tube를 이용한 miniature 배양이 기존의 flask 배양을 대체할 수 있는 훌륭한 배양방법임을 제시해 준다.