• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제18권2호
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• pp.287-294
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• 2008

Three amino acid residues (His119, Glu164, and Glu338) in the active site of Thermus caldophilus GK24 ${\beta}$-glycosidase (Tca ${\beta}$-glycosidase), a family 1 glycosyl hydrolase, were mutated by site-directed mutagenesis. To verify the key catalytic residues, Glu164 and Glu338 were changed to Gly and Gln, respectively. The E164G mutation resulted in drastic reductions of both ${\beta}$-galactosidase and ${\beta}$-glucosidase activities, and the E338Q mutation caused complete loss of activity, confirming that the two residues are essential for the reaction process of glycosidic linkage hydrolysis. To investigate the role of His119 in substrate binding and enzyme activity, the residue was substituted with Gly. The H119G mutant showed 53-fold reduced activity on 5mM p-nitrophenyl ${\beta}$-D-galactopyranoside, when compared with the wild type; however, both the wild-type and mutant enzymes showed similar activity on 5mM p-nitrophenyl ${\beta}$-D-glucopyranoside at $75^{\circ}C$. Kinetic analysis with p-nitrophenyl ${\beta}$-D-galactopyranoside revealed that the $k_{cat}$ value of the H119G mutant was 76.3-fold lower than that of the wild type, but the $K_m$ of the mutant was 15.3-fold higher than that of the wild type owing to the much lower affinity of the mutant. Thus, the catalytic efficiency $(k_{cat}/K_m)$ of the mutant decreased to 0.08% to that of the wild type. The $k_{cat}$ value of the H119G mutant for p-nitrophenyl ${\beta}$-D-glucopyranoside was 5.l-fold higher than that of the wild type, but the catalytic efficiency of the mutant was 2.5% of that of the wild type. The H119G mutation gave rise to changes in optima pH (from 5.5-6.5 to 5.5) and temperature (from $90^{\circ}C\;to\;80-85^{\circ}C$). This difference of temperature optima originated in the decrease of H119G's thermostability. These results indicate that His119 is a crucial residue in ${\beta}$-galactosidase and ${\beta}$-glucosidase activities and also influences the enzyme's substrate binding affinity and thermostability.

• 미생물학회지
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• 제54권2호
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• pp.126-135
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• 2018

여러 종류의 mannanase를 생산하는 Cellulosimicrobium sp. YB-43으로부터 mannanase B를 암호하는 manB 유전자와 효소의 특성이 보고된 바 있다. Mannanase C (ManC)로 명명한 효소의 유전자가 manB 유전자의 하류에 위치한 것으로 예상되어 이를 중합효소 연쇄반응으로 클로닝하여 manC 유전자의 염기서열을 결정하였다. ManC는 448 아미노산 잔기로 구성된 것으로 확인되었으며 glycosyl hydrolase family 5에 속하는 mannanase와 상동성이 높은 활성영역과 탄수화물 결합영역(CBM2)이 존재하였다. ManC의 활성영역은 Streptomyces sp. SirexAA-E (55.8%; 4FK9_A) 및 S. thermoluteus (57.6%; BAM62868)의 mannanase와 아미노산 배열의 상동성이 55% 이상으로 가장 높았다. Signal peptide 영역이 제거되고 카르복실 말단에 hexahistidine이 연결되도록 제조한 His-tagged ManC (HtManC)의 유전자를 재조합 대장균에서 발현하여 균체 파쇄액으로부터 HtManC를 정제하였다. HtManC은 $65^{\circ}C$와 pH 7.5에서 최대 활성을 보였으며 pH 7.5~10범위에서 활성에 큰 변화가 없었다. HtManC는 locust bean gum (LBG)과 konjac에 대한 분해 활성이 guar gum과 ivory nut mannan (ivory nut)에 비해 높았다. 최적 반응조건에서 LBG를 기질로 하여 반응 동력학적 계수를 측정한 결과 Vmax와 Km이 68 U/mg과 0.45 mg/ml로 나타났다. HtManC에 의한 만노올리고당(MOS)과 mannan의 분해산물을 TLC로 관찰한 결과 mannobiose 보다 중합도가 큰MOS로부터 mannobiose와 mannotriose가 주된 분해산물로 생성되었다. 또한 LBG, konjac과 ivory nut의 분해산물로 mannobiose와 소량이 mannose가 공통적으로 관찰되었다.

• 미생물학회지
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• 제52권3호
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• pp.336-343
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• 2016

두 종류의 mannanases를 생산하는 Cellulosimicrobium sp. YB-43로부터 mannanase 유전자를 클로닝하고 그 염기서열을 결정하였다. Mannanase 유전자는 manB로 명명되었으며, 427 아미노 잔기로 구성된 단백질을 코드하는 1,284개 염기로 구성되었다. ManB는 추론된 아미노산 배열에 근거해서 glycosyl hydrolase family 5에 속하는 mannanase와 상동성이 높은 활성영역과 함께 2개의 탄수화물 결합영역을 포함하고 있는 다영역 효소로 확인되었다. Cellulosimicrobium sp. YB-43의 manB 유전자를 함유한 재조합 대장균의 균체 파쇄상등액으로부터 정제된 ManB의 아미노 말단 배열이 QGASAASDG로 결정되었으며 이는 SignalP4.1 server로 그람 음성균을 기준으로 예측된 signal peptide의 결과와 정확하기 일치하였다. 정제된 ManB의 최적 반응조건은 $55^{\circ}C$와 pH 6.5-7.0이며 locust bean gum (LBG), konjac과 guar gum을 가수분해 하였으며, 셀룰로스, 자일란, 전분과 para-nitrophenyl-${\beta}$-mannopyranoside에 대해서는 분해활성이 없었다. ManB의 활성은 $Mg^{2+}$, $K^+$와 $Na^+$에 의해 약간 저해되었으며 $Cu^{2+}$, $Zn^{2+}$, $Mn^{2+}$과 SDS에 의해서는 크게 저해되었다. 또한 이 효소는 mannobiose 보다 큰 중합도를 갖는 만노올리고당을 가수분해하였으며, LBG와 만노올리고당을 가수분해하였을 때 mannobiose가 가장 많은 양으로 생성되었다.

• 생명과학회지
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• 제27권9호
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• pp.1003-1010
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• 2017

Paenibacillus woosongensis의 유전체 부분 염기서열로부터 mannanase를 코드하는 것으로 유추되는 open reading frame을 중합효소연쇄반응으로 증폭하여 대장균에 클로닝하고 염기서열을 결정하였다. Mannanase 유전자는 man26AT로 명명하였으며 1,053 아미노산으로 구성된 단백질을 코드하는 3,159 뉴클레오티드로 이루어졌다. 아미노산 잔기배열을 분석한 결과 Man26AT는 glycosyl hydrolase family 26의 mannanase와 상동성이 높은 활성영역, 탄수화물 결합영역 CBM27과 CBM11로 구성되어 있었다. Man26AT의 아미노산 배열은 P. ihumii의 유추된 mannanase와 상동성이 81%이고 다른 Paenibacillus 속 균주의 여러 mannanases와 57% 이하의 상동성을 보였다. man26AT 유전자를 함유한 재조합 대장균의 균체 파쇄상등액은 $55^{\circ}C$와 pH 5.5에서 최대의 mannanase 활성을 보였고, $50^{\circ}C$에서 1시간 열처리한 후에 80% 이상의 잔존활성을 보였다. Man26AT는 locust bean gum (LBG) galactomannan과 konjac glucomannan에 대한 분해활성이 유사하였으며, carboxymethylcellulose, xylan과 para-nitrophenyl-${\beta}$-mannopyranoside는 분해하지 못하였다. Man26AT에 의해 mannotriose, mannotetraose, mannopentaose와 mannohexaose 등의 만노올리고당이나 LBG로부터 공통의 최종 가수분해 산물로 mannose, mannobiose와 mannotriose가 생성되었다. 또한 mannotriose 보다 큰 만노올리고당이 LBG와 guar gum의 분해산물로 각각 생성되었다. 그러나 Man26AT는 mannobiose를 분해하지는 못하였다. 활성염색을 통해 Man26AT는 균체 내에서 3개 이상의 크기가 다른 활성 단백질로 분해된 것이 확인되었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제21권10호
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• pp.1012-1020
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• 2011

A gene coding for an endoglucanase (EglA), of the glycosyl hydrolase family 12 and derived from Aspergillus niger VTCC-F021, was cloned and sequenced. The cDNA sequence, 717 bp, and its putative endoglucanase, a 238 aa protein with a predicted molecular mass of 26 kDa and a pI of 4.35, exhibited 98.3-98.7% and 98.3-98.6% identities, respectively, with cDNA sequences and their corresponding endoglucanases from Aspergillus niger strains from the GenBank. The cDNA was overexpressed in Pichia pastoris GS115 under the control of an AOX1 promoter with a level of 1.59 U/ml culture supernatant, after 72 h of growth in a YP medium induced with 1% (v/v) of methanol. The molecular mass of the purified EglA, determined by SDS-PAGE, was 33 kDa, with a specific activity of 100.16 and 19.91 U/mg toward 1% (w/v) of ${\beta}$-glucan and CMC, respectively. Optimal enzymatic activity was noted at a temperature of $55^{\circ}C$ and a pH of 5. The recombinant EglA (rEglA) was stable over a temperature range of $30-37^{\circ}C$ and at pH range of 3.5-4.5. Metal ions, detergents, and solvents tested indicated a slightly inhibitory effect on rEglA activity. Kinetic constants ($K_m$, $V_{max}$, $k_{cat}$, and $k_{cat}/K_m$) determined for rEglA with ${\beta}$-glucan as a substrate were 4.04 mg/ml, 102.04 U/mg, 2,040.82 $min^{-1}$, and 505.05, whereas they were 10.17 mg/ml, 28.99 U/mg, 571.71 $min^{-1}$, and 57.01 with CMC as a substrate, respectively. The results thus indicate that the rEglA obtained in this study is highly specific toward ${\beta}$-glucan. The biochemical properties of rEglA make it highly valuable for downstream biotechnological applications, including potential use as a feed enzyme.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제48권2호
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• pp.158-166
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• 2020

Paenibacillus woosongensis의 xylanase 유전자를 클로닝하고 그 염기서열을 결정하였다. Xylanase 유전자는 xyn10A로 명명되었으며, 481 아미노잔기로 구성된 단백질을 코드하는 1,446개 뉴클레오티드로 구성되었다. 추론된 아미노산 배열에 따르면 Xyn10A는 glycosyl hydrolase family 10 xylanase와 상동성이 높은 활성영역과 카르복실 말단에 탄수화물을 결합하는 것으로 추정되는 영역이 포함된 다영역 효소로 확인되었다. DEAE-Sepharose와 Phenyl-Separose 컬럼 크로마토그래피 과정을 통해 P. woosongensis xyn10A 유전자를 함유한 재조합 대장균의 균체 파쇄상등액으로부터 Xyn10A를 정제하였다. 정제된 Xyn10A의 아미노 말단 배열이 GIANGSKF로 결정되었으며 이는 SignalP5.0 server로 예측된 signal peptide의 다음 아미노산 배열과 정확하게 일치하였다. 정제된 Xyn10A는 33 kDa 크기의 절단된 단백질이며 균체내 분해에 의해 카르복시 말단에서 CBM이 제거된 것으로 판단된다. 정제된 효소는 최적 pH와 온도가 6.0과 55-60℃이며 oat spelt xylan에 대한 반응 동력학적 계수 V_max와 K_m이 298.8 U/mg과 2.47 mg/ml로 각각 나타났다. 효소는 birchwood xylan이나 oat spelt xylan보다 arabinoxylan에 대한 활성이 높았으며 para-nitrophenyl-β-xylopyranoside에 대해 낮은 활성을 보였다. Xyn10A의 활성은 Cu²⁺, Mn²⁺과 SDS에 의해서 크게 저해되었으며 K⁺, Ni²⁺과 Ca²⁺에 의해는 상당하게 증진되었다. 또한 이 효소는 xylobiose 보다 중합도가 큰 자일로올리고당을 분해하였으며, 자일로올리고당의 최종 가수분해 산물은 xylose와 xylobiose로 확인되었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제44권3호
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• pp.370-375
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• 2016

가정식 된장에서 mannanase 생산균으로 분리된 Bacillus sp. YB-1401와 B. amyloliquefaciens YB-1402로부터 2개의 xylanase 유전자가 대장균으로 클로닝 되었으며 그 염기서열이 결정되었다. 두 xylanase 유전자는 213개 아미노산 잔기의 단백질을 코드하는 642 nucleotides로 동일하게 구성되었다. Xyn1401과 Xyn1402로 명명된 YB-1401과 YB-1402 xylanase의 아미노산 배열은 127번째 잔기인 Asn과 Lys을 제외하고는 모두 동일하였고, glycosyl hydrolase family 11에 속하는 xylanase의 아미노산 배열과 상동성이 높았다. 두 효소의 signal peptide는 SignalP4.1 프로그램에 의해 아미노 말단의 28 잔기 배열로 동일하게 예측되었다. 두 효소는 91−94%가 재조합 대장균의 배양상등액에 존재하였으므로 대장균에서 효과적으로 분비되는 것으로 판단되었다. Xyn1401과 Xyn1402의 최적 반응조건은 50℃와 pH 6.0, 55℃와 pH 6.5로 각각 달랐으며 이로 보아 오직 한 개의 아미노 잔기의 차이가 온도와 pH에 따른 효소 활성에 영향을 미치는 것으로 확인되었다. 또한 두 효소는 열안정성도 서로 약간 차이가 있었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제45권2호
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• pp.155-161
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• 2017

Paenibacillus woosongensis의 유전체 부분 염기서열로부터 유추된 xylanase 유전자를 PCR 증폭하여 클로닝하고 염기서열을 결정하였다. 클로닝된 xylanase 유전자는 xyn11B로 명명되었으며, 356 아미노산으로 구성된 단백질을 코드하는 1,071 뉴클레오티드로 이루어졌다. Xyn11B의 아미노산 배열을 분석한 결과 glycosyl hydrolase family 11에 속하는 xylanase와 상동성이 높은 활성영역과 탄수화물 결합영역을 포함하고 있는 다영역 효소로 확인되었다. SignalP4.1 server로부터 아미노 말단의 26개 잔기가 signal peptide로 예측되었다. DEAE-Sepharose와 Phenyl-Separose 컬럼 크로마토그래피 과정을 통해 xyn11B 유전자를 함유한 재조합 대장균의 균체 파쇄상등액으로부터 Xyn11B를 부분 정제하였다. 부분 정제된 Xyn11B의 반응특성을 조사한 결과 pH 6.5와 $50^{\circ}C$에서 최대 반응활성을 보였고 birchwood xylan이나 oat spelt xylan보다 arabinoxylan에 대한 활성이 높았으며 셀룰로스, 만난과 para-nitrophenyl-${\beta}$-xylopyranoside에 대해서는 분해활성이 없었다. Xyn11B의 활성은 $Ca^{2+}$과 $Mg^{2+}$에 의해서는 약간 증가한 반면에 $Cu^{2+}$, $Ni^{2+}$, $Fe^{3+}$, $Mn^{2+}$에 의해서는 크게 저해되었고 SDS에 의해서 완전히 저해되었다.

• 농업생명과학연구
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• 제46권2호
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• pp.129-137
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• 2012

A carboxymethyl cellulase gene, cel5B, was cloned, sequenced, and expressed in Escherichia coli. pRCS20 in E. coli was identified from metagenomic cosmid library of cow rumen for cellulase activity on a carboxymethyl cellulose agar plates. Cosmid clone (RCS20) was partially digested with Sau3AI, ligated into BamHI site of pBluescript II SK+ vector, and transformed into E. coli $DH5{\alpha}$. The insert DNA of 1.3 kb was obtained, designated cel5B, which has the activity of hydrolyzation of CMC. The cel5B gene had an open reading frame (ORF) of 1,059 bp encoding 352 amino acids with a signal peptide of 48 amino acids and the conserved region, VIYEIYNEPL, belongs to the glycosyl hydrolase family 5. The molecular mass of Cel5B protein expressed from E. coli $DH5{\alpha}$ exhibited to be about 34 kDa by CMC-SDS-PAGE. The optimal pH was 8.0, and the optimal temperature was about $50^{\circ}C$ for its enzymatic activity.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제19권12호
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• pp.1514-1519
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• 2009

A gene encoding the xylanase of Bacillus subtilis AMX-4 isolated from soil was cloned into Escherichia coli and the gene product was purified from the cell-free extract of the recombinant strain. The gene, designated xylA, consisted of 639 nucleotides encoding a polypeptide of 213 residues. The deduced amino acid sequence was highly homologous to those of xylanases belonging to glycosyl hydrolase family 11. The molecular mass of the purified xylanase was 23 kDa as estimated by SDS-PAGE. The enzyme had a pH optimum of 6.0-7.0 and a temperature optimum of $50-55^{\circ}C$. Xylanase activity was significantly inhibited by 5 mM $Cu^{2+}$ and 5 mM $Mn^{2+}$, and noticeably enhanced by 5 mM $Fe^{2+}$. The enzyme was active on xylans including arabinoxylan, birchwood xylan, and oat spelt xylan, but it did not exhibit activity toward carboxymethylcellulose or p-nitrophenyl-$\beta$-xylopyranoside. The predominant products resulting from xylan and xylooligosaccharide hydrolysis were xylobiose and xylotriose. The enzyme could hydrolyze xylooligosaccharides larger than xylotriose.