• Asian-Australasian Journal of Animal Sciences
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• 제25권5호
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• pp.621-628
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• 2012

The FAT-1 protein is an n-3 fatty acid desaturase, which can recognize a range of 18- and 20-carbon n-6 substrates and transform n-6 polyunsaturated fatty acids (PUFAs) into n-3 PUFAs while n-3 PUFAs have beneficial effect on human health. Fat1 gene is the coding sequence from Caenorhabditis elegans which might play an important role on lipometabolism. To reveal the function of fat1 gene in bovine fetal fibroblast cells and gain the best cell nuclear donor for transgenic bovines, the codon of fat1 sequence was optimized based on the codon usage frequency preference of bovine muscle protein, and directionally cloned into the eukaryotic expression vector pEF-GFP. After identifying by restrictive enzyme digests with AatII/XbaI and sequencing, the fusion plasmid pEF-GFP-fat1 was identified successfully. The pEF-GFP-fat1 vector was transfected into bovine fetal fibroblast cells mediated by Lipofectamine2000$^{TM}$. The positive bovine fetal fibroblast cells were selected by G418 and detected by RT-PCR. The results showed that a 1,234 bp transcription was amplified by reverse transcription PCR and the positive transgenic fat1 cell line was successfully established. Then the expression level of fat1 gene in positive cells was detected using quantitative PCR, and the catalysis efficiency was detected by gas chromatography. The results demonstrated that the catalysis efficiency of fat1 was significantly high, which can improve the total PUFAs rich in EPA, DHA and DPA. Construction and expression of pEF-GFP-fat1 vector should be helpful for further understanding the mechanism of regulation of fat1 in vitro. It could also be the first step in the production of fat1 transgenic cattle.

• 한국수정란이식학회:학술대회논문집
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• 한국수정란이식학회 2002년도 국제심포지엄
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• pp.69-69
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• 2002

Transgenic animals production tools have been valuable for research and purpose. The current methods of gene transfer, microinjection and nuclear transfer, which are widely used in transgenic animal production, but all most methods has only had limited success in production of larger species. Here, we report the possibility of a sperm-mediated gene transfer method in porcine embryos. Oocytes were collected from ovaries harvested at a local slaughterhouse were matured in 500${mu}ell$ drops of TCM-199 under mineral oil at 38.5$^{\circ}C$ in a humidified atmosphere of 5%CO2 in air. After 42-43h of in vitro maturation oocytes were denuded. for sperm injection into the cytoplasm of the porcine oocytes, sperm suspension in NIM medium are subjected extraction with TritonX-100 before mixing with a green fluorescent gene (GFP). Sperm with Tritonx-100 were prepared by adding TritonX-100 to a final volume of 0.05% in the sperm suspension and mixing by trituration for 60s before two wishes in NIM medium at 2$^{\circ}C$. A(ter wishing, sperm were mixed with TritonX-100 at $25^{\circ}C$ followed by washes at 2$^{\circ}C$. Sperm were resuspended in ice cold NIM to a final volume of 400${mu}ell$ and 2-20ng/${mu}ell$ DNA were triturated on ice for 60s. All microinjection was performed in HEPES-buffered CZB medium at room temperature within 2h. After culture in NCSU-23 for 72h, percent of porcine embryos transfected GFP gene are 20.7%(6/29) in 20ng/${mu}ell$ sperm-DNA mixed group and other groups were 3.7 %(2/54)and 4.7%(3/67). These data suggests that sperm-mediated gene transfer method should be used to the production tool of transgenic pig efficiently.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제38권1호
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• pp.42-48
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• 2011

고등식물의 엽록체 유전공학은 핵 형질전환과 비교해 볼때 여러 가지 독특한 장점을 가진다. 높은 transgene 발현율, 상동 재조합에 의한 site-specific transgene의 삽입으로 인해 유전자의 position effect가 없으며, 단일 형질전환으로 동시에 여러 유전자의 도입이 가능하고 모계 유전으로 인해 화분 방출 위험을 감소시킬 수 있다. 담배 specific한 pCtVG (trnI-Prrn-aadA-mgfp-TpsbA-trnA) 벡터를 이용하여 안정적인 감자 엽록체 형질전환 시스템을 개발하였다. 감자 엽록체 게놈으로 외래유전자의 삽입과 homoplasmic level은 PCR과 Southern blot 분석으로 확인하였다. Northern과 immunoblot 분석 및 GFP fluorescence imaging을 통하여 엽록체 형질전환체의 잎에서 GFP 유전자가 강하게 발현, 축적됨을 알 수 있었다. 본 연구에서 확립된 감자 엽록체 형질전환 시스템을 이용하여 유용 유전자를 도입함으로써 농업적 형질을 개선하거나 고부가가치 단백질을 대량 생산하는 감자를 보다 효율적으로 개발할 수 있을 것이다.

• 한국어병학회지
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• 제22권3호
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• pp.375-382
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• 2009

목적 유전자를 숙주 세포의 게놈에 삽입하거나 발현하는데 있어서, retrovirus 매개의 유전자 전달 시스템을 사용하게 되면, 복잡하고 힘든 절차를 거치게 된다. 본 연구에서는 목적 유전자의 BF-2 세포 게놈 내 삽입을 하기 위해, UV로 불활화한 어류 레트로바이러스인 SnRV를 사용한 간단한 방법에 대해 조사하였다. 우선, BF-2 세포를 사용한 transfection을 위해 Lipofectamine 2000과 Transome을 사용하여 최적 조건을 결정하였다. 0.5 $\mu\ell$ Lipofectamine 2000을 사용한 경우 0.5, 1 그리고 2 $\mu{g}$ DNA 사용에 대해 33.8, 40.6 그리고 40.2%의 transfection 효율을 보인 동시에 최소 80 % 이상의 높은 세포 생존율을 나타낸 반면, Transome을 사용한 transfection 효율은 모두 5% 이하였다. UV 처리 시간에 있어서는 5분간의 UV 처리로 SnRV의 감염성이 불활성화되는 것을 확인하였다. 다음으로 GFP 유전자의 양측에 SnRV에서 유래된 LTR 서열을 접하고 있는 cassette를 구축한 뒤 BF-2 세포에 transfection 하고, cassette 유전자의 삽입과 발현을 위해 UV로 불활화한 SnRV를 처리하였다. 그 결과 UV로 불활화한 SnRV를 1회 처리 또는 SnRV 무처리 BF-2 세포에서는 형광이 관찰되지 않았던 반면, 3회와 5회 처리한 BF-2 세포에서 형광발현이 확인되었다. 이러한 결과로, GFP 유전자가 불활화한 SnRV를 이용하여 BF-2 세포 게놈에 삽입되는 것을 확인하였다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제37권1호
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• pp.77-83
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• 2010

국립원예특작과학원에서 분양받은 토마토 18계통을 공시하여 재분화가 잘되는 적정 품종을 탐색한 결과, 계통번호 2001-58에서의 재분화율이 93%로 양호하였다. 또한 식물체로의 재분화 과정에서 보여 지는 갈변현상과 phenolic compound에 의한 식물조직의 괴사현상을 막기 위하여 항산화제인 ascorbic acid와 cystein을 단용 또는 혼용으로 첨가한 후 토마토 재분화에 미치는 영향을 살펴 본 결과, ascorbic acid $200{\sim}300\;{\mu}M/L$ 처리구에서 줄기형성율 및 생체중이 증가되는 현상을 관찰할 수 있었다. 토마토 엽록체 형질전환체 선발을 위해 spectinomycin의 적정 농도를 살펴본 결과, 재분화배지에 spectinomycin 20~25 mg/L 농도가 첨가되어진 처리구에서 재분화가 거의 이루어지지 않았다. 토마토 엽록체 형질전환을 위해 토마토 엽록체 게놈 일부를 분리하여 염기서열을 분석하여 담배와 비교 분석한 결과, homology가 매우 높음을 알 수 있었다. Homologous recombination에 의한 엽록체 형질전환이 되기 위해서 분리한 토마토 엽록체 게놈 일부를 border sequence로 이용하였고, transient assay를 위해 GFP 유전자가 포함된 토마토 엽록체 형질전환용 운반체 pKRT22-AG를 제작하였다. Bombardment을 한 후 원형질체를 나출하여 공초점 현미경하에서 관찰한 결과 엽록체 내에서만 GFP가 발현됨을 알 수 있었으며, DNA 농도 $1\;{\mu}g$, $0.6\;{\mu}m$ gold particle 1 mg, target distance 9 cm 조건이 가장 좋았다.

• 미생물학회지
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• 제48권3호
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• pp.187-191
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• 2012

Two component system (TCS)인 ZraS/R 및 CusS/R의 zraP와 cusC 유전자의 프로모터에 의해 green fluorescent protein (GFP)이 발현되도록 제작된 박테리아 바이오센서의 성능을 인공폐수에서 평가하였다. 제작된 박테리아 바이오센서는 실제 폐수를 모사한 인공폐수에서도 시료 중의 $Zn^{2+}$와 $Cu^{2+}$를 인지하여 GFP를 효율적으로 발현시키는 것을 확인할 수 있었다. 두 번째는 세포 표면에 금속 친화성 펩타이드가 표현되도록 제작된 구리 및 아연 제거 박테리아를 인공폐수 조건에서 평가하였다. 제작된 박테리아는 각각 ZraS/R 및 CusS/R TCS에 의해 주변의 $Zn^{2+}$와 $Cu^{2+}$를 인지하여 세포 표면에 OmpC-ZBP와 OmpC-CBP 융합 단백질을 발현시키는 시스템이다. 실험을 통해 표면에 금속 흡착 펩타이드가 발현된 재조합 균은 인공폐수 조건에서도 효과적으로 구리 및 아연을 흡착시키는 것을 확인하였다. 따라서 본 연구에서 개발된 TCS 기반 재조합 균은 인공폐수 조건에서 중금속의 인지 및 제거 기능이 효과적으로 작동하는 것이 확인되었다.

• Journal of Applied Biological Chemistry
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• 제58권3호
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• pp.273-279
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• 2015

해양 미세조류인 Phaeodactylum tricornutum은 게놈 염기서열이 완전히 밝혀진 규조류로서, 형질전환 방법이 개발되어 있고, 여러 가지 분자생물학적 연구 기술이 개발되어 규조류 연구에서 모델 종으로 여겨지고 있다. 본 연구의 목적은 methylerythritol phosphate (MEP) 대사경로의 마지막 효소인 (E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase (HDR)를 코딩하는 P. tricornutum의 Pthdr 유전자를 P. tricornutum에 도입하여 형질전환체를 확보하는 것이다. 유전자 도입 방법은 gold microcarrier를 사용한 bombardment 방법을 사용하였고, 형질전환 유무 및 목적 유전자의 전사체 확인에는 각각 genomic DNA-PCR 및 cDNA-PCR 방법을 사용하였다. 양성대조군으로 egfp 유전자를 P. tricornutum에 도입하여 최종적으로 eGFP 단백질이 발현되는 것을 형광 공초점 현미경을 통해 확인하였다. 이를 바탕으로, 확보된 Pthdr 형질전환체에서도 도입한 Pthdr 유전자로부터 발현된 PtHDR 효소도 잘 발현될 것으로 추측할 수 있었다. 이렇게 준비된 Pthdr 형질전환체는 추후 연구를 통해, P. tricornum의 유용물질인 카로티노이드의 생합성 과정 연구 및 고부가가치 카로티노이드 과발현 균주 개발 등에 유용한 정보를 제공할 것으로 기대된다.

• 한국작물학회지
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• 제54권1호
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• pp.36-44
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• 2009

본 연구는 다양한 등숙기의 온도 및 일사량 조건에서 종실중 및 종실질소 함량 변화를 조사하여 등숙기 생육온도와 일사량이 벼 종실중 및 종실질소함량의 형성과정과 이들의 최종산물에 미치는 영향을 분석하고자 하였던 바 그 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. 최종 종실중은 연차 및 품종에 관계없이 등숙기 일사량이 높을수록 큰 경향이었으며, 최종 종실중에 도달하는 출수일수는 짧아지는 경향이었다. 2. 종실 질소의 축적기간은 등숙기 적산일사량에 크게 영향을 받았으나 최종 종실질소함량은 큰 영향을 받지 않았다. 3. 유효적산온도(임계온도 $7^{\circ}C$)는 등숙기 생육온도에 관계없이 종실중 및 종실질소함량 변이를 잘 설명하였으나, 유효적산온도 또는 적산일사량에 따른 종실중 및 종실질소 함량은 등숙기 일사량간 변이가 매우 커 이들 단일 요인으로는 등숙기 일사량에 따른 종실중 및 종실질소함량 변이를 설명하는데 한계가 있었다. 4. 유효적산온도 및 적산일사량의 상승적은 등숙기 일사량에 관계없이 종실중 및 종실질소함량 변이를 잘 묘사하였다.

• 한국환경농학회지
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• 제36권4호
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• pp.241-248
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• 2017

본 연구는 최근 RNAi 기반 LMO의 연구 개발이 활발히 진행됨에 따라 향후 이러한 기술을 이용한 LMO의 유해성 및 자연생태계 위해성평가가 필요할 때 실험실 수준에서 dsRNA를 대량으로 발현시키는 시스템을 확립하고, 수분(화분)매개 곤충인 꿀벌을 대상으로 유해성평가 시험을 수행하는 방법을 제시하고자 하였다. L4440 vector에 Snf7과 GFP 유전자를 클로닝한 plasmid를 HT115 (DE3) 대장균에 형질 전환한 후 온도, 배양시간, IPTG 농도를 각기 다르게 하여 최적의 발현조건을 탐색한 결과 $37^{\circ}C$, 0.4 mM IPTG, 4시간의 배양시간에서 가장 많은 양의 dsRNA가 발현됨을 확인하였다. 국내 외 제시된 꿀벌 위해성평가 가이드라인을 바탕으로 대장균에서 분리한 dsRNA를 꿀벌 성충에 급성섭식으로 처리한 결과 생사율과 일반중독증상에서 차이를 보이지 않는 것으로 보아 대장균으로부터 분리한 Snf7 dsRNA와 GFP dsRNA는 꿀벌 성충에 유해하지 않음을 알 수 있었다. 본 연구를 통해 dsRNA 물질의 유해성평가 및 자연생태계 위해성 평가를 위한 대량 추출 방법과 위해성평가 대상종의 사육 및 물질 처리 방법을 확립하여 향후 이뤄질 dsRNA의 꿀벌 위해성평가에 활용될 것으로 사료된다.

• Journal of Animal Science and Technology
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• 제56권7호
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• pp.24.1-24.6
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• 2014

The present study investigated the effects of varying durations of nursery diets differing in percentages of milk products on growth performance of pigs during the nursery phase (NP) and subsequent grow-finish phase (GFP) to find the feasibility of reducing the use of nursery diets containing costly milk products. A total of 204 21-d-old weanling female and castrated male pigs were subjected to one of three nursery phase feeding programs differing in durations on the NP 1 and 2 and GFP diets containing 20%, 7%, and 0% lacrosse and 35%, 8%, and 0% dried whey, respectively, in 6 pens (experimental units) for 33 d: HIGH (NP 1, 2 and 3 diets for 7, 14, and 12 d), MEDIUM (NP 2 and 3 for 14 and 19 d), and LOW (NP 2 and 3 and GFP 1 for 7, 14, and 12 d). Subsequently, 84 randomly selected pigs [14 pigs (replicates)/pen] were fed the GFP 1, 2 and 3 diets during d 54-96, 96-135, and 135-182 of age, respectively. The final body weight (BW) and average daily gain (ADG) of nursery pigs did not differ among the HIGH, MEDIUM, and LOW groups (14.8, 13.3, and 13.7 kg in BW and 273, 225, and 237 g in ADG, respectively). The average daily feed intake during the nursery phase was greater (p < 0.01) in the HIGH group than in the MEDIUM and LOW groups, whereas the gain:feed ratio did not differ across the treatments. The BW on d 182 and ADG during d 54-182 were greater in the HIGH and MEDIUM groups vs. the LOW group (110.0, 107.6, and 99.6 kg in BW, respectively; p < 0.01). The backfat thickness and carcass grade at slaughter on d 183 did not differ across the treatments. In conclusion, the MEDIUM program may be inferior to the commonly used HIGH program in supporting nursery pig growth. Nevertheless, the former appears to be more efficient than the latter in production cost per market pig whereas the LOW program is thought to be inefficient because of its negative effect on post-nursery pig growth.