• Journal of Plant Biotechnology
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• 제48권1호
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• pp.34-43
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• 2021

CRISPR/Cas9에 의한 유전자 교정 기술은 유용 형질을 갖는 작물 및 임목의 육성에 있어 널리 사용되고 있는 핵심 기술이다. 유전자 교정 임목 육성에는 아그로박테리움에 의한 형질전환 방법이 높은 효율로 시행된 연구가 많았고 따라서 형질전환에 사용된 플라스미드 서열이 식물 유전체 안에 존재한다는 문제가 남아 있었다. 본 연구에서는 CRISPR/Cas9을 사용하여 유전자 교정 임목을 육성하는 데 기존에 알려진 벡터 도입 기술이 아닌, 단일 가닥 가이드 RNA (sgRNA)와 Cas9 단백질을 혼합하여 만든 리보핵산단백질을 현사시나무 원형질체에 도입하는 방법을 기술하였다. 염 스트레스 내성 관련 인자 PagSAP1 유전자를 표적으로 하는 3종류의 sgRNA를 디자인하고, 각 sgRNA와 Cas9 단백질을 혼합하여 만든 리보핵산단백질을 원형질체에 도입하였다. 표적화 딥시퀀싱을 통해 리보핵산단백질 형성 시 sgRNA와 Cas9 단백질을 혼합하고 일정 시간 배양하여 안정화되는 시간이 필요한 것을 확인하였다. 또한 sgRNA3의 리보핵산단백질이 sgRNA1, sgRNA2의 리보핵산단백질보다 높은 교정 효율을 보이는 것을 확인하였다. 본 실험을 통해 리보핵산단백질을 이용한 유전자 교정 기술이 임목에도 적용될 수 있음이 확인되었고, 이는 외래 유전자 없이 유전자 교정 임목을 육성하는 데 활용할 수 있을 것으로 사료된다.

• 한국응용곤충학회지
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• 제24권1호
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• pp.45-50
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• 1985

Bacillus thuringiensis 변종(變種)들로부터 Extrachromosomal DNA를 추출분리(抽出分離)코저 종래(從來)의 방법(方法)을 보완(補完)하여 적용(適用)한바 분자량(分子量)의 크기가 1 Megadalton에서 135 Megadalton에 이르는 plasmid들을 분리(分離)함에 보다 효과적(效果的)이었고 또 이 plasmid들을 이용(利用), 제한효소(制限酵素)에 의(依)한 유전자배열작성(遺傳子配列作成) 및 gene Cloning을 하는데 비교적(比較的) 안정(安定)된 많은 양(量)의 세포용해물(細胞溶解物)을 얻을 수 있었다. 파리목과 나비목에 각기(各其) 독성(毒性)이 다른 Bacillus thuringiensis 6개(個) 변종(變種)으로부터 plasmid들을 분리(分離)한 결과(結果) 분자량(分子量)이 큰 50 Megadalton 이상(以上)의 plasmid들이 공시(供試) 된 모든 변종(變種)으로부터 추출(抽出)되었으며 이들 plasmid의 수(數)를 보면 israelensis로부터 8개(個) kurstaki로부터 10개(個) $aizawa{\ddot{u}}$로부터 13개(個) dendrolimus로부터 2개(個), finitimus로부터 1개(個) 그리고 yunnanensis로부터 6개(個)가 각각(各各) 검출(檢出)되었다. 공시(供試)된 변종중(變種中) 4개(個)의 변종(變種)으로부터는 2 Megadalton 이하(以下)의 적은 plasmid들도 추출(抽出)되었다.

• 생명과학회지
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• 제26권3호
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• pp.275-281
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• 2016

인체치료용 당단백질은 바이오의약품에 있어서 중요한 요소이며 특히, 단백질 말단에 결합되어있는 시알산은 의약품의 체내 활성이나 안정성에 큰 영향을 미친다. 최근 돼지유즙은 바이오의약품을 생산하기 위한 생체반응기로써 주목받고 있다. β-1,4-N-acetylglucosaminyltransferase A (MGAT4A)는 재조합단백질이 가지는 시알산 함량을 늘리기 위한 필수 효소 중 하나이다. 그러나 돼지 MGAT4A는 아직도 그 서열이나 기능이 불분명하다. 따라서 이번 연구에서는 돼지 MGAT4A의 서열 동정 및 기능분석을 하였다. 돼지 MGAT4A는 535개의 아미노산을 코딩하는 1,638개의 염기서열로 이루어져 있으며, 일반적인 당전이효소들의 특징인 type II membrane topology의 특성을 가지고 있다. Real-time PCR분석법을 통하여, 지금까지 알려진 것과는 조금 다르게 MGAT4A 유전자가 간이나 유선에서 많은 발현을 보였으나 소장이나 위, 방광에서는 그 발현량이 적다는 것도 확인하였다. 또한, 효소의 기능 분석을 위하여 PK-15 세포주에서 MGAT4A효소의 과발현을 유도하였다. 과발현이 확인된 세포주로 렉틴을 이용한 면역형광염색법과 ELISA방법으로 MGAT4A효소의 과발현이 β-1,4-N-acetylglucosamine의 함량을 증가시켰음을 확인하였다. 또한 기질반응을 통해 bi-antennary structure에 대한 반응성도 확인하였으며, MGAT4A의 과발현이 유도된 세포에서 약 3배 이상의 높은 기질 반응성을 보였다. 이러한 연구는 생체반응기로써 돼지를 이용하는데 있어서 중요한 기반이 될 것이라고 생각한다.

• 대한임상검사과학회지
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• 제48권3호
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• pp.217-224
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• 2016

Acinetobacter baumannii는 병원환경에 광범위하게 분포하고 있으며, 원내감염의 중요한 원인균으로 병원에서 집단감염 일으키고, 중증의 기저질환을 가진 환자에게 감염되면 감염환자의 사망률이 다른 환자에 비해 월등히 높은 것으로 알려져 있다. 본 연구는 충청남도 천안시에 소재한 대학병원 두 곳의 진단검사의학과에 의뢰된 가검물에서 분리한 다제 내성 A. baumannii 85주의 항생제 내성률과 내성유전자 양상에 대해 조사하였다. Carbapenemase와 Class B ${\beta}$-lactamase의 생성균주를 선별하기 위하여 modified Hodge test (MHT)와 IMP-EDTA double-disk synergy test를 실시하였다. 항생제 내성을 유발하는 carbapenemases, 16S rRNA methylases, aminoglycoside-modifying enzymes (AMEs)을 확인하기 위하여 PCR을 시행 하였으며, A. baumannii가 분리된 두 대학병원간 분리균주의 유전학적인 근연도를 확인하기 위해 REP-PCR을 시행하였다. 실험결과 3균주를 제외한 82균주(96.5%)에서 $bla_{OXA-23-like}$과 $bla_{OXA-51-like}$이 검출되었다. $bla_{OXA-23-like}$ 유전자가 검출된 균주에서는 $bla_{OXA-23-like}$ 유전자 상부에 ISAba1 유전자가 확인되어 carbapenemase에 대한 내성을 유도하는 것으로 확인 되었다. Aminoglycoside에 대한 내성을 유발하는 16S rRNA methylase 유전자인 armA는 A병원에서 분리한 38균주 중 34균주(89.5%)에서, B병원에서 분리한 47균주 중 40균주(85.1%)에서 확인되었고, aminoglycoside modifying emzyme 유전자는 A병원 유래 38 균주 중 33 균주(70.2%)에서, B병원 유래 47균주 중 44 균주(93.6%)에서 aac(3)-IIa/ant(2")-Ia/aac(6')-Ib가 확인됨에 따라 천안지역에서 분리되는 대부분의 다제 내성 A. baumannii 균주는 acethyltransferase와 adenyltransferase를 동시에 발현하는 것을 알 수 있었다. 본 실험 결과는 충청남도 천안시에서 분리된 MDR A. baumannii를 대상으로 한 보고서로서, 항생제 내성유형과 내성 유전자의 분포를 확인하여 MDR A. baumannii 균주에 의한 감염증의 치료 지침과 내성세균 확산 방지를 위해 필요한 기초 자료로 활용할 수 있을 것으로 생각된다.

• 정신신체의학
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• 제8권1호
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• pp.46-57
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• 2000

연구목적 : 본 연구는 선택적 세로토닌 재흡수 차단제인 paroxetine과 sertraline의 마우스에 대한 아급성 처치가 강제수영시험에서의 부동자세 시간과 강제수영시험으로 유발된 면역능의 변화에 미치는 영향을 조사하고자 시행되었다. 방법 : 저자들은 실험동물로 각 군마다 5마리 이상의 BALB/c 마우스를 사용하였다. 본 실험동물에서의 적절한 모델을 구축하기 위하여 Porsolt 등의 강제수영시험을 다소 변형하여 각각의 실험 대상군에 적용하였다. 강제수영시험으로 인한 면역 매개변수의 변화를 보기 위하여, 저자들은 anti-rat RBC 항체의 생성, concanavalin 또는 lipopolysaccharide로 유발된 비장세포의 증식과 사이토카인의 유전자 발현 양상을 연구하였다. 결과 : Paroxetine과 sertraline은 모두 투여량에 따라 마우스의 부동자세 시간을 감소시켰다. 강제수영시험을 수행한 마우스는 비세포의 유사분열 반응이 의미 있게 감소되었고, anti-rat RBC 항체는 약간 증가하였다. 이러한 모든 반응은 paroxetine에 의해 의미 있게 감퇴되었고. sertraline에 의해 약간 감퇴되었다. 강제수영시험을 시행한 마우스에서 Con-A로유발된 비세포는 강제수영을 시행하지 않았던 정상대조군보다 IL-4의 강한 발현과 IL-2의 약화된 발현을 보였고, IFN-$\gamma$나 lymphotoxin의 발현은 차이가 없었다. IL-6과 IL-10은 양 군 모두에서 발현되지 않았다. 마우스에서 paroxetine과 sertraline의 전처치는 강제수영으로 인한 사이토카인 발현의 변화를 감퇴시켰다. 그렇지만 선택적 세로토닌 재흡수 차단제가 전처치된 마우스에서는 강제수영군에서 발현되지 않았던 IL-6과 IL-10의 발현이 약간의 변화를 보였다. 결론 : 강제수영시험을 시행한 마우스에서 paroxetine과 sertraline의 전처치는 강제수영시험으로 유발된 행동 및 면역능의 변화를 감퇴시켰다. 이러한 선택적 세로토닌 재흡수 차단제는 사이토카인 유전자 발현 특히 IL-6과 IL-10의 유도를 통하여 면역 체계에 모종의 조절 효과를 발휘하는 것으로 추정되었다.

• Pediatric Infection and Vaccine
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• 제16권1호
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• pp.31-39
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• 2009

목 적: 수막구균(Neisseria meningitides)은 패혈증, 수막염 등 침습성 질환의 중요한 원인의 하나이다. 최근에는 수막구균 다당질-단백 결합 백신이 개발되어 영아의 정기 접종에 포함된 국가도 있다. 우리 나라에서는 건강한 성인의 보유율에 관한 보고는 있으나 소아에서는 수막구균 보균율에 대한 체계적인 보고가 아직 없었다. 본 연구에서는 건강한 유소아를 대상으로 수막구균의 구인두 집락율과 혈청군을 알아 보고자 하였다. 방 법: 2005년 1-2월과 5월에 서울, 경기지역의 13개 어린이집과 유아원에 다니는 소아 904명을 대상으로 하였다. Calcium alginated cotton으로 구인두 점막을 세게 문질러 구인두 도말 검체를 채취한 후 즉시 수막구균 선택배지(modified New York City medium)에 접종하고 $CO_2$ 보육기에서 48시간 배양하였다. 수막구균 동정은 Vitek NHI card를 이용하였으며 중합효소 연쇄 반응을 이용하여 crgA 유전자를 검출하여 확인하였다. 확인된 수막구균은 N. meningitides antisera를 이용한 agglutination test로써 혈청형 A, B, C, D, 29E, W135, X, Y, Z에 대한 검사를 하였으며, 중합효소 연쇄 반응을 이용하여 org2, siaD 유전자의 다양성에 따라 혈청형 A, B, C, W135, Y 여부를 다시 확인하였다. 결 과: 구인두 도말을 채취한 904명의 소아 중 남아는 468명(52%) 이었고 대상 유소아의 연령 분포는 2세 미만이 59명(6.5%), 2세에서 5세 미만은 486명(53.8%), 5-6세는 338명(37.4%)이었고 7세 이상은 21명(2.3%)이었다. 수막구균은 7명의 구인두 검체에서 검출되어 수막구균 보균율은 0.8%이었다. 남아 3명에서 검출되었고 연령별로는 3세 미만에서는 검출 되지 않았고 3세, 4세, 5세 소아에서 각각 1명씩, 그리고 6세 소아 4명에서 검출되었다. 혈청형은 Y군이 3균주, C군과 A군이 각각 2균주이었다. 2군데 유아원에서 각각 2명씩 분리되었고 3군데 유아원에서 1명씩 분리 되었다. 2명이 분리된 유아원 중 한군데는 모두 혈청형 Y가 분리 되었고 다른 유아원에서는 C군과 Y군이 각각 한 명씩 분리되었다. 결 론: 유아원에 다니는 건강한 소아의 구인강내 수막구균 보유율은 매우 낮았으며, 분리된 수막구균의 혈청군은 A, C, Y군이 고루 분포하였다.

• 생명과학회지
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• 제28권7호
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• pp.835-840
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• 2018

본 연구는 시토크롬 P450 단백질을 암호화하는 애기장대 유래의 AtCYP78A7을 과발현하는 형질전환 식물체로부터 AtCYP78A7 단백질을 특이적으로 인식하는 단일큰론 항체의 제조와 그 항체를 AtCYP78A7 단백질과 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 AtCYP78A7 단백질을 효소면역학적(ELISA) 방법으로 검출하는 진단 키트를 개발하기 위하여 수행하였다. 재조합한 GST-AtCYP78A7 단백질을 항원으로 사용하여 단일클론 항체를 분비하는 융합세포주를 제조한 후 비오틴화 및 페어링 테스트를 통해 포획항체와 검출항체를 선정하였으며, GST-AtCYP78A7 정제 단백질을 기준으로 일품벼, 화영벼, AtCYP78A7 과발현 벼(10B-5, 18A-4)의 용해물을 검출항원으로 사용하여 product test를 진행하였다. 그 결과 AtCYP78A7 단백질에 특이적으로 결합하는 4개의 단클론 항체(mAb 6A7, mAb 4C2, mAb 11H6, mAb 7E8)를 생산하였고, 포획항체 mAb 4C2와 검출항체 mAb 7E8-biotin의 조합으로 ELISA 키트를 개발하였다. 개발된 ELISA 키트를 이용한 벼 시료의 분석 결과 AtCYP78A7 과발현 벼는 전체 단백질 대비 AtCYP78A7 단백질의 비율이 0.1% 이상인 양성으로, 일품벼와 화영벼는 0.1% 미만인 음성으로 나타나 키트를 이용한 AtCYP78A7 단백질의 검출이 가능하였으며, 따라서 본 키트는 향후 AtCYP78A7를 과발현하는 형질전환 작물을 대상으로 하는 환경 모니터링 또는 인체 위해성 평가에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 사료된다.

• 한국식품저장유통학회지
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• 제21권6호
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• pp.908-916
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• 2014

가수량이 120%에서 300%로 증가하면서 pH는 4.6에서 4.2로 산도는 6.0에서 5.2로, 아미노산도는 6.0에서 2.5로, 가용성 고형분 함량은 18.4에서 $7.4^{\circ}Brix$로 낮아졌다. 술덧의 알코올 농도는 150%에서 17.6%로 가장 높았고 알코올 생산수율은 각각 59.7, 74.5, 80.8, 82.8, 89.4, 90.6%로 가수량에 의존적으로 증가하였다. 술덧의 유기산 총량은 각각 207.85, 222.38, 222.06, 204.56, 194.34, 204.34 mg/100 mL로 150%와 180%에서 높게 나타났다. 유리아미노산 총량은 각각 474.60, 317.32, 241.89, 244.51, 189.00, 208.12 mg/100 mL로 가수량에 의존적으로 감소하였고 arginine, alanine, glutamic acid, glycine, isoleucine, leucine, lysine, phenylalanine, proline, serine, tyrosine, valine이 주요 성분이었다. Iso-butanol은 154.88~182.62 ppm, iso-amylalcohol은 320.59~394.47 ppm, 1-propanol은 91.50~170.91 ppm, 2-phenylalcohol은 108.93~144.26 ppm농도로 분포하고 있고 ethyl acetate, acetaldehyde, furfural, butyric acid가 검출되었다.

• KSBB Journal
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• 제23권3호
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• pp.231-238
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• 2008

암세포의 침윤은 숙주 조직의의 기저막과 세포외 기질을 침투함으로써 일어난다. 침윤과 전이과정에는 단백질가수분해 효소인 matrix metalloproteinases (MMPs)가 깊이 연관되어 있는 것으로 알려져 있으며, MMP의 가수분해 활성은 tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs)라는 억제 단백질에 의해 억제된다. TIMP-2는 21kDa 크기의 포유류 단백질로 대장균에서 과발현 시 다른 많은 포유류 단백질과 마찬가지로 가용성이 낮은 봉입체 형태로 발현된다. TIMP-2 단백질의 접힘에 6개의 이황화결합이 필요하고, 이는 일반적으로 대장균 환경은 적합하지 않다. 본 연구에서는 대장균에서 불가용성으로 발현되는 TIMP-2 유전자를 유전자셔플링 기법의 한 가지인 StEP (staggered extension process)를 변형하고 동시에 $Mn^{2+}$ 농도 변화와 dGTP 불균형을 이용한 무작위 돌연변이 기법을 혼용하여 대장균에서 가용성 TMP-2 재조합 변이체를 생성하고자 하였다. 무작위로 재조합된 TIMP-2 유전자 중에서 가용성으로 발현되는 TIMP-2 유전자를 선별하기 위해서 chloramphenicol acetyltransferase (CAT)-융합 방법을 도입하였다. CAT 유전자가 가용성으로 발현되는 재조합 TIMP-2 유전자에 융합되면 이를 갖는 E. coli는 높은 chloramphenicol 환경에서 생존이 가능하게 된다. 이러한 in virro mutageuesis 기법과 CAT-융합 방법으로 대장균 가용성 TIMP-2 재조합 변이체를 14가지 얻을 수 있었다. 변이체 TIMP-2의 아미노산서열 분석과 구조 분석 결과 주로 소수성 아미노산이 친수성 아미노산으로 전환되었고, MMP와의 결합이 관여하지 않는 C-말단 부위에 돌연변이가 집중되어 있었다. 본 연구에서 개발된 간편하고 새로운 in vitro 재조합 방법과 CAT을 이용한 스크리닝 기법은 다른 많은 대장균 내 불가용성 단백질의 발현에도 사용될 수 있을 것으로 사료된다.

• 대한핵의학회지
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• 제39권5호
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• pp.278-283
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• 2005

목적 : 저자들은 이전 연구에서 $^{99m}Tc$-GC을 합성해 생체내 분포를 확인했다. 그 결과 GC은 고도의 간 특이성을 보였으며, 간 특이 영상을 위한 방사성 의약품으로서의 가능성을 확인할 수 있었다. 그러나 $^{99m}Tc$-GC는 표지 수율과 안정성 면에서 불만족스러운 결과를 보였다. 이번 연구는 GC를 메틸화하는 방법과 HYNIC의 도입을 통해 표지수율과 안정성을 향상시킬 수 있는지 알아보고, 그와 함께 이 화합물들의 세포 독성에 대해 연구해 보고자 하였다. 대상 및 방법 : 합성한 GC, GMC, GCH를 $^{99m}Tc$로 표지하고 상온과 사람 혈청에서 표지 안정성을 측정하였으며, 6시간까지 시행하였다. 각 화합물을 0, 0.5, 1, 1.25, 5, 10, 25, 100 ${\mu}g/ml$ 농도로 첨가한 HeLa와 HepG2 세포를 18시간동안 배양한 뒤 세포 생존능을 MTT를 이용해 측정하였다. 결과 : 표지 후 실온에서의 안정성 실험을 한 결과 이동상으로 아세톤을 사용한 경우 $^{99m}Tc$-GC는 15분에 96%, 1시간에 88%였고, $^{99m}Tc$-GMC는 15분, 1시간. 6시간에서 각각 100%, 97%, 89%의 향상된 표지율을 보였고 $^{99m}Tc$-GCH는 6시간까지 95% 이상을 보여 안정성이 보다 더 향상됨을 확인하였다. 또한 이동상으로 생리 식염수를 사용한 경우 $^{99m}Tc$-GC는 15분, 1시간에 73.9%, 72%를 보였고, $^{99m}Tc$-GMC의 경우 15분, 1시간, 6시간에서 96.3%, 95.8%, 75.6%의 표지율을 보였다. $^{99m}Tc$-GCH는 90% 이상의 표지 안정성을 보였고, 사람 혈청에서 6시간까지 95.7%의 표지율을 보였다. MTT를 시행한 결과. 각 화합물을 처리한 세포주의 생존능은 대조군과 비교할 때 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 결론 : 저자들은 GC를 메틸화하는 방법과 HYNIC의 도입을 통해 새로운 간세포 특이적 지향성을 갖는 키토산 화합물을 합성하였고, 이 화합물들은 $^{99m}Tc$으로 표지할 때 향상된 표지 수율과 뛰어난 표지 안정성을 보였다. 그리고 각 화합물들의 세포 독성 역시 원래 키토산과 의의있는 차이가 없이 매우 낮은 정도임을 증명하였다.