벼 약배양에서 배지 물리성과 생장조절제가 약배양 효율에 미치는 영향을 조사하기 위하여, N/ sub 6/, 배지에 배지 응고제인 agar와 Gelrite의 농도를 달리하여 캘러스 형성률, 식물체 재분화율과 재분화 식물체의 배수성 등을 조사하였고, 이에 따른 적정 생장조절제의 종류와 농도를 구명하였다. 캘러스 유기배지의 agar 농도를 0.8, 1.2, 1.6%와 Gelrite 농도를 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0%로 달리하여 약을 배양한 결과, 캘러스 형성률은 agar 농도가 증가함에 따라서 감소하였으나, 식물체 재분화율과 기내 자연배가이배체의 재분화율은 agar농도에 비례하여 증가되었다. Gelrite 배지에서의 캘러스 형성률은 0.4%와 0.6%에서 67.6%와 54.8%로 agar 배지에서보다 높았으며, 녹색체 재분화율은 0.6%에서 27.6%로 가장 높았다. 기내 자연배가이배체 및 다배체 재분화율은 Gelrite 농도에 비례하여 증가하였다. 0.6% Gelrite 배지에서 캘러스 형성에 미치는 생장조절제의 효과는 2 mg/L NAA가 65.2%의 높은 캘러스 형성률과 34.7%의 녹색체 분화율을 보여 가장 높았다. 따라서 N$_{6}$ 배지에 2 mg/L NAA와 0.6% Gelrite 조합이 캘러스 형성률, 식물체 재분화율 및 기내 자연배가이배체재분화율 등이 모두 agar 배지보다 크게 증가하여 벼의 약 양 배지로 가장 적합하였다.
To identify the effects embryo developmental stage and gelrite concentration on plant regeneration in seed culture of rice, mature and immature seeds of rice were cultured on the $N_{6}$ medium supplemented with2 mg/$\ell$ 2.4-D and different levels of gelrite(0.2~1.0%). The calli formed immature embryos were produced more plants than those from mature embryos. The maximum frequency of plant regeneration was achieved in the culture of the calli of immature embryos which was harvested at the 21$^{th}$ day after pollination. The plant regeneration on the medium with gelrite was more accelerate than that on the medium with agar. The highest frequency(55%) of plant regeneration was obtained from the calli transferred to the medium with 6g/$\ell$ gelrite.
본 연구는 소나무의 삼투압제 종류 및 농도, gelrite 농도에 따른 체세포배 발생 및 abscisic acid (ABA) 농도, 배발생 조직 라인에 따른 체세포배 발아 효과를 조사하기 위해 수행되었다. 삼투압제 종류 및 농도에 따른 체세포배 발생비교에서 최대의 체세포배 유도 수는 0.1 M maltose+3.75% polyethylen glycol (PEG) 4000 처리구에서 45개 (/90 mg FW)로 나타났으며, 0.2 M maltose 처리구 또한 41개로 효과가 있었다. Gelrite 농도에 따른 체세포배 발생비교에서 0.4 및 0.6%의 농도에서는 전혀 체세포배가 유도되지 않았으며, 0.8% 이상의 농도부터 체세포배가 발생되는 경향을 보였다. 최대 체세포배 유도 수는 1.0% gelrite에서 41개로 가장 높은 유도 수를 보였으며, 0.8 혹은 1.2%에서의 농도에서 또한 각각 37.3 및 39.7개로 높은 유도수를 보여 0.8% gelrite 이상에서 체세포배 유도 효과가 있었다. ABA농도, 배발생조직 라인 및 활성탄 첨가에 따른 체세포배 발아율 비교에서 06-6조직라인의 경우 150 혹은 $200{\mu}M$ ABA 처리구 유래 체세포배를 0.2% 활성탄첨가 배지에서 배양한 경우 45%의 최대 발아율을 보였다. 활성탄 무첨가 배지의 경우 최대 발아율은 06-6라인, $250{\mu}M$ ABA 처리구 유래 체세포배에서 28.9%로 나타났다.
본 연구는 소나무의 배발생조직 라인 간 증식율, 체세포배 유도 및 발아율의 효과를 조사하기 위해 수행되었다. 소나무 미숙접합배로부터 유도된 15개 배발생조직 라인 간 증식율 비교에서 05-4 라인은 5.3배의 최대 증식율을 보인 반면, 05-37라인은 1.4배로 가장 저조하여 조직 라인 간 증식율 차이가 크게 나타났다. 배발생조직 13개 라인의 체세포배 유도에서는 05-4라인에서 39.8개(90 mg 조직기준)를 유도하여 가장 높았지만 전체적으로는 단지 5개 조직라인(05-4, 12, 21, 29 및 37)에서만 체세포배 유도가 가능하였다. 나머지 8개 라인에서는 전혀 유도되지 않아 조직라인 간 체세포배 유도효율의 큰 차이를 보였다. 3개의 조직라인에서 유래한 체세포배의 발아비교에서 05-4라인 유래 체세포배 발아율이 0.2% gelrite에서 가장 높은 47.3%로 나타났으나, 05-4 및 29라인에서는 0.2% 이상의 gelrite 농도에서 발아율이 점차 감소하는 경향을 보였다. 한편 05-37 라인 유래 체세포배의 발아는 0.1 혹은 0.2% 농도에서는 전혀 발아가 이루어지지 않아 gelrite 농도에 따른 발아율 차이를 나타냈다. 결론적으로 소나무의 배발생조직 라인 간 증식율, 체세포배 발생 효율 및 발아효과는 배발생조직 라인에 따라 크게 좌우되는 경향을 보였다.
돌나물 유전자원의 기내 활성보존을 위하여, 10mm 크기의 기내배양 shoot를 agar, Gelrite, ABA 및 sucrose 농도를 달리한 MS 배지에 치상하여, $4^{\circ}C$와 $25^{\circ}C$에서 계대배양 없이 보존하였다. 배지는 $0.2mg{\cdot}L^{-1}$ BA를 기본으로 첨가하였고, agar와 Gelrite 배지에는 5% sucrose, ABA 배지에는 5% sucrose와 1.2% agar, sucrose 배지에는 1.2% agar를 각각 첨가하였다. 상온 활성보존($25^{\circ}C$)에서 sucrose와 Gelrite 배지는 생장억제 효과가 거의 없었고, $0.2mg{\cdot}L^{-1}$ BA + $10mg{\cdot}L^{-1}$ ABA + 1.2% agar, 또는 $0.2mg{\cdot}L^{-1}$ BA + 1.6% agar를 첨가한 배지가 효과적이었으며, 계대배양 없이 10개월까지 활성보존이 가능하였다. 저온 활성보존($4^{\circ}C$)에서 12개월후 생존율은 모든 배지에서 100%였으며, $10mg{\cdot}L^{-1}$ ABA, 또는 6% sucrose 첨가배지에서 계대배양 없이 18개월 이상의 활성보존이 가능하였다. 특히 고농도 sucrose 배지는 저온 활성보존($4^{\circ}C$)에서 돌나물 유전자원의 장기간 활성유지에 가장 효과적이었다.
벼 약배양 배지에 첨가되는 배지응고제의 종류와 농도가 캘러스형성 및 식물체재분화에 미치는 영향을 구명하기 위하여 실험한 결과는 다음과 같다. 배지응고제인 Bacto agar(Difco, 04140-01), Agrose(Sigma, Type 1) 0.4% 처리에서 각각 39%, 55%의 캘러스형성율을 보였으나 농도가 높아질수록 캘러스 형성율이 현저하게 감소하였다. Gelrite(Kelco, 143364)의 0.2~0.8%처리에서는 농도에 따른 차이가 인정되지 않았으며 0.6% 처리에서 44%의 캘러스 형성율을 보였다. 고농도 배지응고제 처리에서 형성된 캘러스는 생장이 늦은 반면 작고 단단하며 백색에 가까운 배발생적인 특성을 보였다. 식물체재분화율은 고농도 배지응고제 처리에서 형성된 캘러스에서 양호하였으며, 또한 고농도 배지응고제가 첨가된 식물체분화배지에서 높았다. 저농도 배지응고제 처리에서 형성된 약치상후 60일된 캘러스는 식물체 재분화율이 급격히 감소하였다. 치상된 약에 대한 최종적인 식물체분화 효율을 향상시키기 위해서는 0.6∼0.8% Gelrite 첨가배지에서 형성된 캘러스를 1.6% Bacto agar 및 Agarose 또는 0.8% Gelrite 식물체분화배지에 이식할 것을 추천한다.
한란(Cymbidium kanran)의 급속증식을 위한 식물생장 조절물질과 항산화제의 처리결과, 2.5 g/1 gelrite가 생장과 경제적인 면에서 우수하였는데, 9 g/1 시약한천보다 적은 약 28% 정도의 양과 절반 정도의 가격으로 우수한 결과를 나타났다. 식용한천은 시약한천에 비해 절반 정도의 가격으로 거의 비슷한 생육을 보였다. BA와 NAA의 농도가 높을수록 배지의 갈변도가 심하였으며, 식물생장조절물질의 작용을 억제하였다. polyvinylpyrrolidone (PVP, M.W. 40,000)이 ascorbic acid, aspartic acid, rutin 보다 우수 항산화제인 것으로 나타났다. 식물생장조절물질 처리에서는 0.1-1.0 mg/1 BA와 0.1 mg기 NAA, 1 g/1 PVP 처리구가 가장 좋은 생육을 보였다. 따라서 한란의 경우 급속한 개체 증식을 위해서는 MS 기본배지에 2.5 g기 gelrite를 불활성 지지물로 사용하고, 0.1-1.0 mg/1 BA 수준에 0.1 mg/1 NAA를 처리하고, 1 g/1 PVP 첨가를 통해 배지의 산화를 억제하여 배양기간을 연장하고, 식물생장조절물질의 역할이 정상적으로 작용하도록 하여 적은 양의 식물생장조절물질의 사용으로 강건한 묘를 확보할 수 있는 것으로 나타났다.
사과에서 효율적인 형질전환 체계를 마련코자 'Mclntosh Wijcik' 형질전환체 계통을 이용하여 재분화 및 발근 배지내 kanamycin 농도에 따른 반응을 조사하였다. Gelrite 고형 재분화 배지에서는 $150mg{\cdot}L^{-1}$의 고농도에서도 재분화율에 대한 저해 정도는 낮았으나, 정상 신초 재분화 면에서는 $100mg{\cdot}L^{-1}$이상의 농도에서 는 저해 정도가 높았다. Agar 고형 발근배지에서 kanamycin 농도에 따른 발근 반응은 계통간 차이를 보여, $30mg{\cdot}L^{-1}$이상의 농도에서 발근율이 크게 저해되는 계통과 거의 영향을 받지 않는 계통이 존재하였다. 또한 이들 형질전환체 계통간 발근율 차이는 전이 유전자 삽입수보다는 삽입 위치에 따른 효과로 보아졌다. 따라서 'McIntosh Wijcik' 품종의 형질전환시 gelrite 고형 재분화 배지내 적정 kanamycin 농도는 $100mg{\cdot}L^{-1}$정도로 판단되며, 형질전환체에 대한 일차적인 간접선발에 적당한 agar 고형 발근배지내 kanamycin 농도는 $30mg{\cdot}L^{-1}$정도인 것으로 판단되었다.
반하의 기내 조직배양을 통해 소괴경 생산을 하고자 적합한 식물생장조절제 처리조건, 배지와 처리 농도, 고형지지물의 종류와 농도를 조사하였다. 기내 소괴경 형성에 적합한 식물생장조절물질과 농도 조건을 연구 한 결과 0.1mg/l 2,4-D와 0.5 mg/l BAP 혼합처리에서 잎 (3.9개)과 엽병 (4.7개) 배양모두 최고치의 소괴경을 생산할 수 있었다. 기내 소괴경 형성에 적합한 배지는 SH배지로 나타났으며 잎과 엽병 배양에서 4.5와 5.2개의 소괴경을 생산하였으며, 최적 농도는 SH 배지의 무기염류를 반으로 줄인 1/2 SH배지가 가장 효과적이었다. 기내 소괴경 생산에 적합한 고형지지물과 그 농도를 조사한 결과, 잎과 엽병 배양 모두 agar보다 gelrite에서 소괴경 형성이 잘 되었으며, 농도별로는 agar 6%, Gelrite는 4% 처리에서최고치의 소괴경을 생산할 수 있었다. 기내에서 생산된 소괴경은 5$^{\circ}$C에서 1개월간 냉장 보관 후에 생장상에서 MS 고형배지가 든 배양용기와 멸균 소독한 상토에 옮겨 발아율을 조사한 결과, MS고형 배지에서 자란 소괴경은 86%의 발아율을 보였으며, 멸균 소독한 상토에서는 43%의 발아율을 보였다. 추후 반하 소괴경의 발아율과 토양 적응성을 높이는 연구보강으로 소경을 번식용 종자로 활용할 수 있는 방안을 모색할 예정이다.
Genetic transformation was affected by material of explant, age of callus, and medium of regeneration. Two rice seed cultivars (Ilpum and Baekjinju) and mediums were investigated in this study for enhancing regeneration of transgenic rice expressed AtBI-1 gene encoding the Arabidopsis thaliana Bax inhibitor. Regeneration rate of Ilpum rice transformant in gelrite of 5 and 8 g were 27.4% and 18.0%, respectively. In Baekjinju, regeneration rate of transformant was 5.4% and 4.3% in 5 and 8 g gelrite, respectively. The highest number of transformant plant in this study was regenerated from Ilpum cultivar on MS medium (30.4%) and was applied for the subsequent experiment. The callus regeneration rate of transformant were 40.7% in callus infection of up-side, it was higher regeneration then in the down-side (3.9%). The regeneration rate of callus of 25 days and 35 days were 14.7% and 38.6%, respectively. The most important application of this work is in genetic transformation of rice, particularly for improvement transgenic plant tissue culture protocol with high frequency of plant regeneration.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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