• 한국어병학회지
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• 제37권1호
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• pp.147-153
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• 2024

The World Organization for Animal Health (WOAH) recommends two protocols (ITS and COI) for conventional PCR of G. salaris diagnosis. However, ITS PCR protocol may yield false-positive results, leading to unnecessary countermeasures. It's difficult to distinguish between G. salaris and false-positive by similar amplicon size of PCR, since the amplicon size of ITS PCR in G. salaris and false-positive was 1,300 and 1,187 bp, respectively. The nucleotide sequences of ITS false-positive in rainbow trout is 99.7% identical to previously reported host genome sequences of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) and 95.3 to 89.1% identical to those of other salmonid fish species. To reduce false-positive PCR band, PCR was performed by the different annealing temperature, but PCR bands were still detected. In RFLP analysis by HaeIII, the PCR product of G. salaris was digested into four bands of 512, 399, 234 and 154 bp, while the false-positive was digested into seven bands of 297, 263, 242, 144, 93, 80 and 68 bp. In the RFLP patterns digested by HindIII, G. salaris showed two bands of 659 and 640 bp, while false-positive had one fragment of 1,187 bp without any digestion. Therefore, the RFLP method of ITS PCR with HaeIII and HindIII can be used for differentiation between G. salaris and false-positive. These results might provide important information on the improvement of PCR diagnostic method of G. salaris.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제11권5호
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• pp.788-797
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• 2001

The usefulness of three PCR methods were evaluated for the epidemiological typing of Staphylococcus aureus: an enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence PCR (ERIC-PCR), repetitive extragenic palindromic element PCR (REP-PCR), and 16S-23S intergenic spacer PCR (ITS-PCR). The analysis was performed using a collection of S. aureus strains comprised of 6 reference and 79 isolates from patients with various diseases. Among the 85 S. aureus strains tested, 6 references and 6 isolates were found to be susceptible to methicillin, whereas the remaining 73 isolates were resistant to it. PCR methods are of special concern, as conventional phenotypic methods are unable to clearly distinguish among methicillin-resistant S. aureus (MRSA) strains. The ability of the techniques to detect different unrelated types was found to be as follows: ERIC-PCR, 19 types; REP-PCR, 36 types; and ITS-PCR, 14 types. On the basis of combining the ERIC, REP, and ITS fingerprints, the 85 S. aureus strains were grouped into 56 genetic types (designated G1 to G56). The diversities for the 85 S. aureus strains, calculated according to Simpson\`s index, were 0.88 for an ERIC-PCR, 0.93 for a REP-PCR, and 0.48 for an ITS-PCR, and the diversity increased up to 0.97 when an ERIC-PCR and REP-PCR were combined. The above discrimination indices imply that the genetic heterogeneity of S. aureus strains is high. Accordingly, this study demonstrates that DNA sequences from highly conserved repeats of a genome, particularly a combination of ERIC sequences and REP elements, are a convenient and accurate tool for the subspecies-specific discrimination and epidemiologic tracking of S. aureus.

• 한국연초학회지
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• 제37권1호
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• pp.25-33
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• 2015

Genome walking is a par ticular application for identifying sequences of unknown genomic regions adjacent to a known region. Many genome walking methods based on polymerase chain reaction (PCR) are available. Even if earlier techniques suffer from low reproducibility, inefficiency, and non-specificity, improved strategies have been developed. In this study, we present an alternative strategy: the genomic DNA is digested with restriction enzymes. After cytosine overhangs at 5' ends, the fragments are ligated to linker adaptor s had guanine overhang at 3' ends. Then nested PCR is performed. The improvements in this strategy focus on two points. The first is the C tailing method using Pfu polymerase instead of the A tailing method based on nontemplate-dependent terminal transferase activity of Taq polymerase. Therefore unintended modification of target DNA can be prevented without A tailing error. The second point is the use of C/G-specific ligation had advantage in the ligation efficiency compared with A/T-specific ligation. Therefore, the C-G linker PCR method increases ligation efficiency between digested genomic DNA and adaptor DNA. As a result, the quantity of target DNA to amplify by PCR is enriched. We successfully used G-C linker PCR to retrieve flanking regions bordering the phophinothricin resistance gene in genetically modified tobacco (GMO).

• 한국식품영양과학회지
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• 제29권6호
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• pp.1016-1024
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• 2000

본 연구는 식품에 존재하는 L. monocytogenes균의 신속한 검출방법을 조사하기 위하여 hlyA 유전자 primer 를 사용하여 PCR 기법으로 행하였으며 primer의 특이성과 PCR의 민감성, L. monocytogenes균의 검출을 위한 최적조건 및 우유 및 소고기의 적용시험을 각각 조사하였다 PCR 특이성 실험에서는 L. monocytogenes 20주에 대한 PCR 분석 결과 모두 713 bp 크기의 PCR products를 확인할 수 있었고, Listeria spp. 및 다른 세균에서는 동일한 Poducts가 증폭되지 않으므로써 hiyA based primer의 L. monocytogenes에 대한 PCR 특이성이 관찰되었다. PCR 분석법의 민감도는 L. monocytogenes ATCC 19111의 1 pg DNA와 2.4$\times$$10^4$cell 수준에서 target DNA가 증폭되었다. Tailing의 제거와 민감도를 높이기 위하여 PCR cycle 수에 따른 최적조건을 조사한 결과 20~30 cycle 정도의 PCR clcyle 수가 좋은 것으로 나타났으며 민감도는 20 cycle PCR amplification을 행한 후 한번 더 10~15 cycle로 처리했을 때 훨씬 증가하였다. 한편, 우유(10 mL)와 쇠고기 절편(10g)에 0~$10^{7}$ CFU/mL 또는 g 수준으로 L. monocytogenes를 신속하게 검출하기 위하여 PCR을 적용한 결과, 우유시료에서는 2번 PCR을 반복함으로써 2 cells까지 검출할 수 있었고, 쇠고기 절편은 LEB로 35$^{\circ}C$에서 24시간 증균하여 PCR합으로써 2.6$\times$$10^2$cell가지 검출할 수 있었다.

• 산업식품공학
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• 제15권4호
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• pp.370-375
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• 2011

현재 식중독 미생물의 검사에 전통적인 배지법이 다수를 차지하고 있으나 PCR이나 면역 분석법과 같은 신속 검출 법들의 사용이 증가하는 추세이다. 그러나 대개 speciesspecific 프라이머를 이용한 PCR에 의한 DNA 증폭산물을 전기영동을 통해 확인하는 방법을 사용하고 있는데 이는 각종 균주에 대해 각기 다른 프라이머를 사용하여야하는 단점이 있다. 이러한 단점을 보완하기 위하여 본 연구에서 는 여러 가지 균주를 동시에 신속하게 검지할 수 있도록 PCR-DGGE 기술을 연구하게 되었다. 그 결과 6종(S. typhimurium, P. fluorescens, B. cereus, S. aureus, E. coli, L. monoytogenes)의 유해 미생물을 선정하였고 DGGE 상에서 확실한 분리능을 보여 유해미생물의 인공마커로 사용할 수 있음을 보였다. 또한 실제 PCR-DGGE 기법을 사용하기 위하여 채소에서의 유해미생물 검출 감도를 확인한 결과 B. cereus를 제외한 5종(S. typhimurium, P. fluorescens, S. aureus, E. coli, L. monoytogenes)의 균들은 모두 $10^1$ CFU/g까지 검출할 수 있었고 B. cereus는 $10^3$ CFU/g이상 채소에 존재할 때 검출할 수 있었다. 또한 균질화 방법에 따라서 식물 DNA와 유해 미생물 간의 경쟁적 증폭현상이 일어남도 확인할 수 있었다. 이로써 본 연구에서는 유해 미생물의 검지, 인공마커의 제조, 식물 DNA와 유해미생물간의 경쟁적 증폭 현상 방지책과 유해미생물의 검출 감도 확인 및 염기서열을 통한 동정을 통해 PCR-DGGE가 식품에서 유해 미생물의 신속 검지 방법으로써 활용할 수 있을 것으로 사료된다. 향후 국내 식품소비 패턴이 유기농 채소의 수요와 공급이 날로 증대 되고 있기 때문에 PCR-DGGE 기법이 유기농 채소들의 식중독 균에 대한 database를 구축하여 안전성을 확보하는데 기여할 수 있다고 생각된다.

• 생명과학회지
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• 제22권1호
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• pp.110-116
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• 2012

누룩은 탁주와 약주의 제조를 위한 당화효소와 알코올발효를 위한 미생물의 공급원으로서 제품의 맛과 품질을 결정하는 중요한 역할을 한다. 본 연구에서는 산성누룩의 세균과 진균의 다양성을 조사하기 위해 순수분리 종과 16S 및 28S rRNA gene를 대상으로 한 PCR-DGGE를 이용한 분석을 수행하였다. 누룩 내 세균의 수는 $2.7{\times}10^9$ CFU/g이었으며 순수분리와 PCR-DGGE 분석에서 우점종은 Kocuria spp., Pantoea spp., Lactobacillus spp., Pediococcous spp., Weissella spp., Staphylococcus spp. 그 외 endophytic bacterium, uncultured gamma-proteobacteria, uncultured Cyanobacteria와 Actinobacteria였다. PCR-DGGE profile에서 주된 우점종은 Pediococcous pentosaceus와 uncultured Cyanobacteria 이었다. 누룩 내 진균의 수는 $3.5{\times}10^8$ CFU/g이었으며 순수분리와 PCR-DGGE 분석에서 우점종은 Trichomonascus spp., Pichia spp., Torulaspora spp., Wickerhamomyces spp., Sacharomycopsis spp., Lichtheimia spp., Mucor spp., Rhizopus spp., Aspergillus spp., Cladosporium spp.였다. PCR-DGGE profile에서 주된 우점종은 Pichia kudriavzevii와 Aspergillus oryzae이었다. PCR-DGGE 기술은 본 연구에서 누룩의 미생물군집을 평가하기 위해 처음으로 사용되었으며 미생물 다양성을 설명하는 데 효과적임을 입증하였다.

• 한국어병학회지
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• 제24권2호
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• pp.65-73
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• 2011

패류 내에 오염되어 있는 바이러스의 검출에 있어서 정성 정량적 분석이 기능하며 신속하고 간편한 방법의 개발을 이루고자 하였다. 5g의 굴 중장선 조직을 Glycine buffer 및 PEG 8000 용액을 사용하여 제조한 농축 시료 (T5g-D)와 50mg의 굴 중장선 조직으로부터 직접적으로 제조한 시료(sT5Omg-D)를 대상으로 2-step PCR을 실시하여 검출감도를 비교하였다. 동일한 1 ${\mu}l$의 DNA template T5g-D와 sT50mg-D를 사용하였을 때, 35cycles의 1-step PCR에서 양성의 결과를 얻을 수 있었다. 인위적으로 sT50mg-D 혼합 시료를 사용하여 2-step PCR (35cycles)을 실시하였을 때 T5g-D를 사용한 것과 비교하여 뚜렷한 차이를 나타내지 않았다. 또한 megalocytivirus에 오염된 양성시료 0.5~50mg을 사용하여 조제한 각각 $50{\mu}l$의 template DNA 1 ${\mu}l$를 사용하여 qPCR을 하였을 때 6.14E+00~1.2E+02/${\mu}l$의 농도를 함유하고 있는 것으로 나타났다. 조제한 template DNA에 6.14E+00 copies/${\mu}l$ 이하의 농도가 있을 때는 qPCR에서 positive의 결과를 얻을 수 없었다. 결론적으로 패류 내 mega1ocytivirus의 오염 유무 판단을 위한 2-step PCR 및 qPCR에서 50mg의 중장선을 사용하는 것은 i) 굴의 조직으로부터 오염된 megalocytivirus의 정성 및 정량을 위한 최소 검출 한계에 벼하여 충분한 양이었으며 ii) 개체별 분석이 가능하다는 장점이 있었으며 iii) 이를 토대로 국내에서 서식하고 있는 굴에서 megalocytivirus의 오염을 확인할 수 있었다.

• 한국식품위생안전성학회지
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• 제34권3호
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• pp.290-295
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• 2019

최근 한국에서 발생한 Salmonella로 인한 식중독 사고는 2018년 9월 학교급식에서 제공된 초콜릿 무스 케이크가 원인이 되었다. 이 연구의 목적은 Salmonella Typhimurium이 인위적으로 접종된 무스케이크와 티라미수에서 3M Molecular Detection Assay 2 - Salmonella와 식품공전에 등재된 방법인 분리배지와 real-time PCR을 비교하는 것이었다. 무스케이크 2종과 티라미수 2종 25 g에 225 mL BPW를 넣고 $37^{\circ}C$에서 24시간 동안 증균 배양하였다. 배양 후, 3M Molecular Detection Assay 2 - Salmonella, 분리배지 그리고 real-time PCR로 분석하였다. 초콜릿 무스 케이크를 제외하고 3가지 방법은 유사한 결과를 보였다. 초콜릿 무스 케이크에서 분리배지와 3M Molecular Detection Assay 2 - Salmonella는 모든 접종수준에서 동일한 결과를 나타낸 반면 real-time PCR은 $10^4CFU/25g$ 수준에서 1번의 양성결과를 제외하고 모두 검출되지 않았다. 초콜릿 무스에 S. Typhimurium을 $10^2CFU/25g$ 수준으로 접종하였을때, real-time PCR를 이용한 검출은 15%에서는 부분적인 음성을 나타냈고, 20-100% 함량의 초콜릿 무스에서는 모두 음성이었다. Real-time PCR로는 chocolate이 15% 이상 함유된 식품에서의 Salmonella균 검출이 불가능하였지만, LMAP 기반의 3M Molecular Detection Assay 2으로는 chocolate 농도에 관계없이 검출이 가능하였다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제17권10호
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• pp.1616-1621
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• 2007

We have established a SYBR Green-based realtime PCR method using AnyDirect solution, which enhances PCR from whole blood, for direct amplification of the virA gene of Shigella flexneri and the invA gene of Salmonella typhimurium from human feces without prior DNA purification. When we compared the efficiency of conventional or realtime PCR amplification of the virA and invA genes from the supernatant of boiled feces supplemented with S. flexneri and S. typhimurium in the presence or absence of AnyDirect solution, amplification products were detected only in reactions to which AnyDirect solution had been added. The detection limit of real-time PCR was $1{\times}10^4\;CFU/g$ feces for S. flexneri and $2{\times}10^4\;CFU/g$ feces for S. typhimurium; this sensitivity level was comparable to other studies. Our real-time PCR assay with AnyDirect solution is simple, rapid, sensitive, and specific, and allows simultaneous detection of S. flexneri and S. typhimurium directly from fecal samples without prior DNA purification.

• 미생물학회지
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• 제41권3호
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• pp.168-176
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• 2005

갯벌 퇴적물에 존재하는 병원성 해양미생물인 Vibrio vulnificus를 신속하고 정확하게 검출하기 위해 PCR, Southern hybridization 방법과 real-time PCR을 수행하여 검출 민감도를 비교하였다. 갯벌 퇴적물로부터 bead beater를 이용한 물리적 방법으로 DNA 조추출액을 얻고 상용화된 키트 (Geneclean turbo Kit)를 이용하여 부식물질(humic substances)을 제거하였다. 병원성에 관련된 3 종의 유전자(hemolysin, vvhA; phosphomannomutase, pmm; metalloprotease, vvpE)를 대상으로 설계한 프라이머 셋을 동시에 사용하는 multiplex PCR 방법과 Southern hybridization과 병행한 방법(PCR/Southern hybridization)을 수행하였다. Real-time PCR은 hemolysin 유전자(vvhA)에 특이한 프라이머와 TaqMan 탐침을 사용하였다. 전처리하지 않은 갯벌 퇴적물의 경우, PCR/Sourthern hybridization과 real-time PCR 방법의 검출 민감도는 퇴적물 1 g 당 약 $10^2$ 개의 세포 수준이었다. 농후처리액(APW; alkaline peptone water)으로 $35^{\circ}C$에서 $2{\~}3$시간, 8시간 중균 배양할 경우 갯벌 퇴적물 1 g 당 $2{\~}10$개 세포가 존재할 때 PCR/Southern hybridization 방법과 real-time PCR 방법으로 각각 검출할 수 있었다. 전처리 과정을 포함하여 real-time PCR은 $6{\~}7$시간, PCR/Sourthern hybridization은 약 36시간이 소요되었다.