• KSBB Journal
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• 제22권5호
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• pp.305-312
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• 2007

가능한 한 대량의 균주를 테스트하여 고생산성을 지닌 균주를 신속히 선별하기 위해서는 소규모 액상배양 방법의 확립이 필수적인데, 강력한 지질저하제인 monacolin-K의 생산균주인 균사형성 Monascus의 경우 포자나 균사체의 형성이 활발하지 않은 배양 생리적 특성으로 인해 소규모 (miniature) 액상배양이 매우 어려운 문제점이 있다. 본 연구에서는 monacolin-K 고생산성 균주개량의 효율성을 큰 폭으로 증가시키고자, 기존의 플라스크 액상배양 방법을 소규모화시킨 tube 배양 방법을 개발함으로써 단기간에 보다 많은 양의 균주를 테스트하고자 하였다. 이차대사산물인 monacolin-K의 생합성은 각각의 배양단계에서의 생산균주의 배양형태가 중요한데, 특별히 최종 생산배양에서 생산성 증가에 심각한 영향을 미치는 배양형태인 직경 1 mm 이하의 pellet 모양을 유도하기 위해서는 성장배양 시에 반드시 고농도의 균사모양이 유도되어야 하는 것으로 관찰되었다. 50 ml tube (7 ml의 조업부피)를 이용하는 소규모 액상 성장배양의 경우 solid seed 배양 단계에서의 포자형성배지의 조성을 통계적 방법을 통해 최적화하고, 또한 성장배지 성분에 brown rice 가루 20 g/L를 첨가할 때, 원하는 균사모양의 배양형태가 유도됨을 확인할 수 있었다. 한편 7 ml의 조업부피의 tube를 이용한 소규모 성장배양 방법의 개발로 인해, 기존의 flask 배양을 이용할 때보다 단기간에 훨씬 많은 변이주의 생산성을 조사하게 되어 균주개량 속도를 큰 폭으로 향상시킬 수는 있었으나, 선별된 개별 균주의 monacolin-K의 생산성은 오히려 전체적으로 감소하는 경향을 보여 주었다. 이러한 결과는 소규모 배양방법을 확립하기 위해 새로이 개발한 포자형성배지와 성장배지의 조성변화로 인해 기존에 확립된 생산배지에서는 생산균주의 monacolin-K 생합성 능력이 최대로 발휘되지 않았기 때문에 발생한 것으로 판단되었다. 따라서 본 연구를 통해 확립된 소규모 성장배양에 적합한 최적의 생산배지 조성을 확립하고자 통계적 방법인 Plackett-Burman design을 적용하여 monacolin-K 생산성 향상에 영향을 주는 glycerol, malt extract, yeast extract, brown rice의 4가지 성분들을 최종 선별하였고, 또한 이들의 최적농도 결정을 위해 반응표면분석 실험을 수행하였다. 이와 같이 결정된 최적 생산배지를 사용하여 생산배양을 수행한 결과, monacolin-K의 생산성이 2배 이상 증가하고, 배양 형태 또한 용존산소와 영양분의 전달이 매우 용이한 직경 1mm 이하의 pellet 모양을 유지함을 확인할 수 있었다.

• KSBB Journal
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• 제22권5호
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• pp.297-304
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• 2007

Lovastatin은 근사형성 균류인 Aspergillus terreus가 생합성하는 이차대사산물로 강력한 고지혈증 치료제로 널리 이용되는 물질이다. 본 연구에서는 lovastatin 고생산변이주를 이용하여 포자배지 최적화를 통한 miniature 배양 방법을 확립하고자 하였다. 우선 miniature 배양에 필수적인 효과적인 포자 형성 방법을 개발하고자 포자 형성 배지의 통계학적 배지 최적화를 수행하였다. Miniature 배양의 inoculum으로 이용되는 대량의 포자를 획득하기 위해 Plackett-Burman 실험법을 이용하여 포자 형성을 향상시키는 성분을 조사한 결과, glucose, sucrose, yeast extract 그리고 $KH_2PO_4$가 주목할 만한 효과를 보였다. 상기 성분의 최적 농도를 확인하기 위해 반응표면분석법 (RSM)을 이용한 결과, PDA 포자 형성 배지와 비교하여 볼 때, 최적 성분 농도에서 포자 형성이 약 190배 증가하였다. 최적화된 포자형성 배지를 이용하여 lovastatin 고생산성 변이주의 대량 선별을 위한 miniature 배양 방법을 확립하기 위해 기존의 실험 과정에 'PaB (adaptation)'라는 한 번의 계대배양을 더 추가한 결과 생산균주의 안정성과 재현성이 큰 폭으로 증가하는 주목할 만한 결과를 얻을 수 있었다. 단기간에 가능한 한 다량의 균주를 스크리닝하기 위해 성장배양과 생산배양 모두 조업부피가 7 ml인 tube를 이용해 miniature 배양을 반복 수행하여, lovastatin 생산성과 배양형태가 훌륭한 변이주를 선별할 수 있었는데, 이 균주는 7 ml tube배양과 250 ml flask배양 (조업부피 50 ml) 모두에서 생산성이 높은 것으로 보아 산소 의존도가 비교적 낮고 생산 안정성이 높은 균주인 것으로 판단되었다. 한편 miniature 배양을 이용해서 lovastatin 고생산성을 보이는 균주를 신속 선별하기 위해서는 균주의 적절한 배양형태 유도가 매우 중요한 것으로 관찰되었다. 즉 생산배양으로의 고활성 균주의 접종을 위해서, 또한 생산배양에서 pellet의 배양형태 유도를 위해서 성장배양 시에는 반드시 고농도의 균사모양을, 생산배양 시에는 직경 1 mm 이하의 pellet모양의 배양 형태를 유지해야만, 생산균주가 lovastatin을 안정적으로 고생산할 수 있는 것으로 관찰되었다. 초기에 선별된 균주를 이용하여 miniature 배양에 의해 고속 균주선별 실험을 반복함으로써 고생산성 균주들을 다량 선별할 수 있었는데, 이들의 lovastatin 생산성을 조사한 결과, 기존의 flask 배양대비 오차범위가 $\pm$20% 이내의 생산성을 보이는 균주가 초기 선별시의 32%에 비해 81%로 크게 증가함을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는 lovastatin 고생산성, 고안정성 균주의 고속 스크리닝을 위해서 본 연구에서 개발한 tube를 이용한 miniature 배양이 기존의 flask 배양을 대체할 수 있는 훌륭한 배양방법임을 제시해 준다.

• KSBB Journal
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• 제24권1호
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• pp.30-40
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• 2009

Aspergillus terreus에 의한 이타콘산 생산 발효공정에서 생산균주의 성장을 어느 정도 제한시킴으로써 배양생리적 특성이 이타콘산 생합성 쪽으로 치우치도록 통계적 방법을 적용하여 itaconic acid의 생산배지 조성을 최적화하는 연구를 수행하였다. 이타콘산은 TCA회로를 거쳐 합성된 cis-aconitic acid의 디카르복실화 반응에 의해 생합성되는 고부가 화학원료물질이다. 우선 One factor at a time (OFAT) 방법을 이용하여 이타콘산의 생산성 증가에 크게 영향을 미치는 중요한 탄소원들로 sucrose, glucose, fructose와 soluble starch를 확인할 수 있었고, 질소원들로는 cottonseed flour와 soybean meal을 찾을 수 있었다. Fractional factorial design을 통하여 이들 6가지 요인들 간의 상호작용의 정도를 확인한 결과 sucrose와 cottonseed flour간의 상호작용의 정도가 가장 컸고, 나머지 요인들 간의 상호작용의 정도는 작거나 혹은 이타콘산 생산에 오히려 부정적인 결과를 나타냈다. 또한 full factorial design (FFD) 실험을 통해 생산배지에 $KH_2PO_4$와 $MgSO_4$가 과량 첨가되면 이타콘산의 생산성이 심각하게 저해됨을 알 수 있었다. FFD의 1차모델식을 근간으로 하여 최급상승법 (steepest ascent method, SAM)을 적용하여 sucrose, cottonseed flour, $KH_2PO_4$ 및 $MgSO_4$의 최적 농도로 향하는 가장 가파른 기울기를 구함으로써, 신속하고 효율적으로 최적 농도지점에 대한 정보를 얻을 수 있었다. SAM이 제시해주는 농도 부근에서 반응표면분석 (response surface method, RSM)을 적용하여 각 배지성분의 농도를 최적화시키기 위해, 2개의 중요한 요인인 sucrose와 cottonseed flour를 이용하여 중심합성계획 (central composite design, CCD) 실험을 수행하였다. 그 결과 이타콘산의 최적 배지 조건은 sucrose 90.4 g/L, cottonseed flour 53.8 g/L인 것으로 관찰되었고, 이 농도에서 이타콘산의 생산성은 초기 사용된 배지에서의 생산성에 비해 약 7배 증가한 4360 mg/l로 나타났다. 이로부터 탄소원 (C)으로 사용한 sucrose와 질소원 (N)으로 사용한 cottonseed flour 간의 C/N 비율이 이타콘산의 생산성에 큰 영향을 미친다는 것을 확인할수 있었다.

• 생명과학회지
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• 제27권1호
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• pp.57-66
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• 2017

약용식물의 발효는 새로운 식품의 소재 개발이 가능하나, 발효 균주는 대부분 이스트, 유산균, 박테리아 등이 이용되고 있다. 본 연구에서는 감초와 번데기 단독 또는 감초에 발효원인 번데기를 20%와 50%로 첨가한 혼합물의 배지에 눈꽃 동충하초(Paecilomyces tenuipes)와 밀리타리스 동충하초(Cordyceps militaris)를 이용하여 고체배양방법을 확립하였다. 동충하초 발효물을 식품소재로 개발하기 위하여 식용 가능한 용매인 에탄올 95%, 70%, 50%, 25% 및 물로서 추출한 다음 동충하초로부터 생성된 cordycepin과 감초의 지표성분인 liquiritin, liquiritigenin과 glycirrhizin의 함량 및 NO생성 억제효과를 조사하였다. Cordycepin함량은 감초에 번데기를 50%로 혼합한 배지에 밀리타리스 동충하초 균주을 접종하여 발효한 발효물을 70% EtOH추출하였을 경우에 가장 많았으며, 번데기를 첨가하지 않은 밀리타리스 동충하초 발효물 추출물보다 함량이 33배 정도 증가하였다. 또한 추출용매의 극성이 70% EtOH보다 높거나 낮아지면 감소하는 경향이었으며, 특히 발효원으로서 번데기의 첨가는 cordycepin의 함량을 현저하게 증가시켰다. Liquiritin의 함량은 발효하지 않은 감초보다 눈꽃 동충하초와 밀리타리스 동충하초로 발효한 모든 추출물에서 감소하였다. Liquiritigenin의 함량은 눈꽃 동충하초로 발효한 추출물이 밀리타리스 동충하초 발효 추출물보다 현저히 증가하였으나, 밀리타리스 동충하초 균쥬의 발효 추출물은 발효하지 않은 감초 추출물과 거의 차이가 없었으며, 두 균주 모두 번데기의 첨가량이 증가할수록 liquiritigenin의 함량이 감소하는 경향이었다. 감초에 번데기의 첨가량 또는 추출 용매의 극성이 증가하면 liquiritin과 glycyrrhizin의 함량은 현저히 감소하였다. 이상의 결과로부터, cordycepin 함량은 C. militaris 균주로 liquiritigenin은 P. tenuipes로 발효시에 현저하게 증가하였으나, liquiritin과 glycyrrhizin은 감소하였다. 감초를 동충하초로 발효시에 번데기의 첨가는 주요 성분의 변화를 현저하게 유도하였다. 동충하초 발효 추출물은 NO생성 억제효과가 증가하였으며, 고극성 용매 추출물에서 그 효과가 현저하였다. 감초의 발효시에 생성된 cordycepin과 liquiritin, liquiritigenin 및 glycyrrhizin의 함량은 발효원으로서 첨가되는 번데기, 추출용매의 극성, 발효 균주의 종류 등에 따라서 현저한 차이가 있었다. 이러한 결과는 동충하초 균주를 이용한 기능성 식품 소재를 개발하기 위한 기초 자료로서 활용이 가능할 것으로 기대된다.

• 한국식품위생안전성학회지
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• 제35권5호
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• pp.438-446
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• 2020

메주와 누룩은 한국 전통 발효 식품에 사용되는 스타터로, Aspergillus속 곰팡이나 aflatoxin에 노출되기 쉽다. 본 연구에서는 우리나라에서 시판되는 57개의 메주 시료와 18개의 누룩 시료로부터 Aspergillus 속 곰팡이를 분리하고 동정하였다. 분리주의 aflatoxin 생성 가능성을 평가하기 위하여 multiplex PCR을 통해 aflatoxin 생합성 유전자(aflO, aflP, aflR)를 확인하고, 이들 분리주에 의해 생성되는 aflatoxin 함량을 HPLC로 조사하였다. 뿐만 아니라 시판 메주와 누룩 시료 중 aflatoxin 함량을 분석하였다. 그 결과, 메주 시료로부터 130개, 누룩 시료로부터 47개 균주가 분리되어 총 177개의 분리주를 확인 및 동정하였다. 각각 메주와 누룩으로부터 분리된 19.2% (25/130), 10.6% (5/47)의 분리주가 3 종류의 aflatoxin 생합성 유전자를 모두 보유하였으며, 그 중 메주로부터 분리된 5개의 분리주가 실제로 aflatoxin을 생성하였다. 시판 메주와 누룩 시료 중 aflatoxin 함량을 분석한 결과, 88% (51/58)의 메주 시료의 aflatoxin 오염 수준은 모두 검출한계 미만으로 나타났고, 누룩 또한 시료의 39% (7/18)가 검출한계 미만으로 확인되었다. 메주와 누룩에서 분리된 분리주 중 aflatoxin 생합성 유전자를 모두 보유하거나 배지 상에서 aflatoxin 생성을 보여준 aflatoxigenic 균주는 존재하였으나 유통되고 있는 시료에서 aflatoxin 오염 빈도는 낮은 수준임을 확인할 수 있었다.

• 한국초지조사료학회지
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• 제40권2호
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• pp.80-86
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• 2020

본 연구는 볏짚 사일리지의 곰팡이 독소 저감을 위한 효율적 방안으로 화학적 처리 방법에 따른 효능에 관한 진보적 연구 자료를 제공하고자 실시하였다. 화학적 처리 방법으로 암모니아 및 가성소다를 이용 곰팡이독소에 오염된 볏짚의 4% 수준으로 각각 처리하고 사일리지 저장에 따른 곰팡이독소 저감, 발효 품질 및 섬유소 소화에 미치는 영향을 평가 하였다. 모든 실험구에서 Aflatoxin B₁, B₂, G₁, G₂ 그리고 Fomonisin B₁, B₂ 뿐만 아니라 Dexynivalenol은 검출되지 않았으며, Ochratoxin A와 Zearalenone이 검출되었다. 그리고 Ochratoxin A은 대조구(41.23g/kg)보다 화학적 처리구에서 낮게 검출되었다(p<0.05). Zearalenone은 대조구(600.33㎍/kg) 및 암모니아 처리구(376.00㎍/kg)에 비하여 가성소다 처리구(297.44㎍/kg)가 더 낮은 결과를 나타내었다(p<0.05). 볏짚 사일리지의 pH는 암모니아 처리구(4.63)가 가장 낮았고, 가성소다 처리구가 가장(8.19) 높았다(p<0.05). lactic acid 함량은 대조구와 암모니아 처리구(10.85와 10.98mM)는 유사한 수준이었으나 가성소다 처리구(8.80mM)가 가장 낮았다(p,0.05). Propionic acid는 대조구(0.55mM)가 화학처리구에 비하여 높았으며(p<0.05), 암모니아와 가성소다 처리구간(0.09와 0.07mM)에는 유사한 함량을 나타내었다. 화학처리에 따른 볏짚 사일리지의 반추위 미생물의 NDF 및 ADF의 분해율 모두 가성소다 처리구가 가장 높은 분해율을 보였고 다음으로 암모니아 처리구이었으며, 대조구가 가장 낮은 수준을 나타내었다(p<0.05). 따라서 본 연구결과는 볏짚 사일리지 제조공정에서 암모니아 및 가성 소다 처리가 곰팡이 독소 저감 및 볏짚 사일리지의 반추위 미생물 분해율 증진에 좋은 영향을 주는 것으로 사료되며, 가성소다 처리는 암모니아 처리에 비하여 곰팡이 독소 저감 및 섬유소 분해율 증진에 더 효율적이었으나 사일리지 발효에는 비효율적 영향을 준 것으로 사료된다.

• 한국버섯학회지
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• 제12권3호
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• pp.201-208
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• 2014

버섯배지의 발효를 효율적으로 행하면서 버섯의 재배 시 빈번하게 발생하는 푸른곰팡이 병의 원인 균주인 Trichoderma sp. 곰팡이 성장을 억제하는 세균의 분리를 행하였다. 균원시료로부터 1차 분리한 약 200여 균주 중에서 성장속도가 빠르고, SM, AM 및 CM의 평판배지 상에서 clear zone이 뚜렷한 6균주를 2차 분리하였다. 분리한 6균주 중 cellulase, amylase 및 protease의 효소활성이 높고 T. virens와 T. harzianum에 대하여 강한 항균활성을 나타낸 C-1균주를 최종 분리균주로 선정하였다. 분리한 C-1균주는 Bergey's Manual of Systematic Bacteriology에 의한 동정과 16S rDNA 염기서열 분석을 행한 결과 Paenibacillus polymyxa 밝혀져 P. polymyxa CK-1으로 명명하였다. P. polymyxa CK-1균주의 생육조건을 검토한 결과 최적배양온도는 $45^{\circ}C$, 생육을 위한 배지의 최적 pH는 6.0~7.0 범위로 나타났다. T. virens와 T. harzianum 곰팡이의 생육억제를 위한 P. polymyxa CK-1의 배양시간은 22~36시간이 적당하였다. 그리고 P. polymyxa CK-1균주의 24시간째 배양용액을 처리한 petri dish에 두 곰팡이를 각각 접종한 후 10일 동안 방치하여도 곰팡이의 생육은 관찰되지 않았다. P. polymyxa CK-1 균주가 생산한 길항물질의 열안정성을 검토한 결과 $60^{\circ}C$ 및 $100^{\circ}C$로 20분 동안 처리한 시험구에서는 두 곰팡이의 균사성장이 전혀 관찰되지 않았지만 $121^{\circ}C$에서 20분 동안 처리한 시험구에서는 약간의 균사성장이 관찰되었다. P. polymyxa CK-1배양액이 버섯균사 생육에 미치는 영향을 검토한 결과 팽이버섯, 표고버섯 등의 다양한 버섯균사 생육에 전혀 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.