• Applied Biological Chemistry
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• 제41권1호
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• pp.47-52
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• 1998

3-Hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A (HMG-CoA) 환원효소는 식물의 병원균 방어물질 (phytoalexin), 광합성 색소 (the phytol of chlorophyll), 성장 호르몬 (abscisic acid와 gibberellin 등) 및 스테롤 (phytosterol) 등의 생합성에 관여하는 주효소이다. 암조건 하에서 발아 후 4일째의 벼 유묘 microsome을 재료로 비이온성 detergent 인 Brij W-1 (final 0.4%)을 사용하여 가용화 시킨 후, DEAE-Sephadex A-50 크로마토그래피 칼럼과 hexaneagarose를 matrix로 기질인 HMG-CoA를 결합시켜 제조한 친화성 크로마토그래피 칼럼을 이용하여 세포막 결합효소인 HMG-CoA 환원효소를 정제하였다. 정제된 HMG-CoA 환원효소의 최종 회수율은 7.14% 였고, 분자량은 10% SDS-PAGE에서 55 kDa이였다 HMG-CoA 환원효소의 최적 반응 온도는 $37^{\circ}C$, 최적 반응 pH는 6.9였고, 기질인 HMG- CoA에 대한 HMG-CoA 환원효소의 $K_m$ 및 $V_{max}$ 값은 $180\;{\mu}M$과 107 pmol/mg, 수소공여체인 NADPH에 대한 $K_m$과 $V_{max}$값은 $810\;{\mu}M$과 32.1 pmol/min/mg이였다.

• 생명과학회지
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• 제29권10호
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• pp.1126-1135
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• 2019

세포 외로 단백질분해효소를 생산하는 효모 균주 CO-1을 대나무 부산물에서 분리하였다. CO-1은 원형 또는 타원형($3.1-4.0{\times}3.8-4.4{\mu}m$)으로, 생장을 위한 최적 온도는 $30^{\circ}C$, 초기 pH는 4.0이었다. 그리고 최대 15.0% (w/v)의 NaCl과 9.0%(v/v)의 ethanol 농도에서 생장하였다. 형태적, 생리 생화학적 특성 및 18S rRNA 유전자 염기서열을 통한 계통분석을 이용하여 동정을 실시한 결과 Pichia anomala로 판명되었다. P. anomala CO-1 단백질분해효소를 부분 정제한 결과 수율은 7.2％였으며, 정제 전에 비해 약 14.6배 정제되었다. Zymogram으로 측정한 효소의 분자량은 약 30 kDa으로 확인되었다. 본 균주는 배지 중에 탄소원과 질소원, 무기염으로 1.0%(w/v) CMC와 1.0%(w/v) yeast extract, 0.3%(w/v) $MnSO_4$를 사용하였을 경우 가장 높은 단백질분해효소 활성을 나타내었다. P. anomala CO-1이 생산하는 단백질분해효소의 최적 활성 pH와 온도는 각각 7.0과 $30^{\circ}C$였다. 또한 본 효소는 pH 4.0-10.0에서 75%의 안정성을 나타내었으며, $65^{\circ}C$에서 1시간 가열하여도 60％ 전후의 활성을 유지하였다. 균주의 효소 생산은 생육과 비례하였으며 대수증식기 후반에 최대의 효소 생산을 나타내었다.

• 한국축산식품학회:학술대회논문집
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• 한국축산식품학회 2004년도 정기총회 및 제33차 춘계 학술대회
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• pp.89-119
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• 2004

This study was conducted to isolate lactobacilli having probiotic characteristics to be used as health adjuncts with fermented milk products. Acid tolerant strains were selected in Lactobacilli MRS broth adjusted to pH 4.0 from 80 healthy persons (infants, children and adults). And bile tolerant strains were examined in Lactobacilli MRS broth in which 1.0% bile salt was added. By estimation above characteristics, the strains No. 27, which was isolated from adult feces, was selected and identified as Lactobacillus salivarius subsp. salivarius based on carbohydrate fermentation and 16S rDNA sequencing. It was used as a probiotic strain in fermented milk products. The pH of fermented milk decreased from pH 6.7 to 5.0 and titratable acidity increased from 0.3% to 1.0% by L. salivarius subsp. salivarius (isolation strain 20, 35, and 37), when incubated for 36 h at $37^{\circ}C$. The number of viable cell counts of fermented milk was maximized at this incubation condition. The SDS-PAGE evidenced no significant change of casein but distinct changes of whey protein were observed by isolated L. salivarius subsp. salivarius for titratable acidity being incubated by $0.9{\sim}1.0%$ at $37^{\circ}C$. All of the strains produced 83.43 to 131.96 mM of lactic acid and 5.39 to 26.85 mM of isobutyric acid in fermented products. The in vitro culture experiment was performed to evaluate ability to reduce cholesterol levels and antimicrobial activity in the growth medium. The selected L. salivarius subsp. salivarius reduced $23{\sim}38%$ of cholesterol content in lactobacilli MRS broth during bacterial growth for 24 hours at $37^{\circ}C$. All of the isolated L. salivarius subsp. salivarius had an excellent antibacterial activity with $15{\sim}25$ mm of inhibition zone to E. coli KCTC1039, S. enteritidis KCCM3313, S. typhimurium M-15, and S. typhimurium KCCM40253 when its pH had not been adjusted. Also, all of the isolated L. salivarius subsp. salivarius had partial inhibition zone to E. coli KCTC1039, E. coli KCTC0115 and S. enteritidis KCCM3313 when it had been adjusted to pH 5.7. The selected strains were determined to have resistances of twelve antibiotic. Strains 27 and 35 among the L. salivarius subsp. salivarius showed the highest resistance to the antibiotics. Purified ${\alpha}$-galactosidase was obtained by DEAE-Sephadex A-50 ion exchange chromatography, Mono-Q ion exchange chromatography and HPLC column chromatography from L. salivarius subsp. salivarius 27. The specific activity of the purified enzyme was 8,994 units/mg protein, representing an 17.09 folds purification of the original cell crude extract. The molecular weight of enzyme was identified about 53,000 dalton by 12% SDS-PAGE. Optimal temperature and pH for activity of this enzyme were $40^{\circ}C$ and 7.0 respectively. The enzyme was found to be stable between 25 and $50^{\circ}C$. ${\alpha}$-galactosidase activity was lost rapidly below pH 5.0 and above pH 9.0. This enzyme was liberated galactose from melibiose, raffinose, and stachyose, and also the hydrolysis rate of substrate was compound by HPLC. These results indicated that some of the L. salivarius subsp. salivarius (strain 27 and 35) are considered as effective probiotic strains with a potential for industrial applications, but the further study is needed to establish their use as probiotics in vivo.

• Journal of Microbiology
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• 제45권2호
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• pp.158-167
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• 2007

In this study, we have cloned a novel cDNA encoding for a papain-family cysteine protease from the Uni-ZAP XR cDNA library of the polychaete, Periserrula leucophryna. This gene was expressed in Escherichia coli using the T7 promoter system, and the protease was characterized after partial purification. First, the partial DNA fragment (498 bp) was amplified from the total RNA via RT-PCR using degenerated primers derived from the conserved region of cysteine protease. The full-length cDNA of cysteine protease (PLCP) was prepared via the screening of the Uni-ZAP XR cDNA library using the $^{32}P-labeled$ partial DNA fragment. As a result, the PLCP gene was determined to consist of a 2591 bp nucleotide sequence (CDS: 173-1024 bp) which encodes for a 283-amino acid polypeptide, which is itself composed of an 59-residue signal sequence, a 6-residue propeptide, a 218-residue mature protein, and a long 3'-noncoding region encompassing 1564 bp. The predicted molecular weights of the preproprotein and the mature protein were calculated as 31.8 kDa and 25 kDa, respectively. The results of sequence analysis and alignment revealed a significant degree of sequence similarity with other eukaryotic cysteine proteases, including the conserved catalytic triad of the $Cys^{90},\;His^{226},\;and\;Asn^{250}$ residues which characterize the C1 family of papain-like cysteine protease. The nucleotide and amino acid sequences of the novel gene were deposited into the GenBank database under the accession numbers, AY390282 and AAR27011, respectively. The results of Northern blot analysis revealed the 2.5 kb size of the transcript and ubiquitous expression throughout the entirety of the body, head, gut, and skin, which suggested that the PLCP may be grouped within the cathepsin F-like proteases. The region encoding for the mature form of the protease was then subcloned into the pT7-7 expression vector following PCR amplification using the designed primers, including the initiation and termination codons. The recombinant cysteine proteases were generated in a range of 6.3 % to 12.5 % of the total cell proteins in the E. coli BL21(DE3) strain for 8 transformants. The results of SDS-PAGE and Western blot analysis indicated that a cysteine protease of approximately 25 kDa (mature form) was generated. The optimal pH and temperature of the enzyme were determined to be approximately 9.5 and $35^{\circ}C$, respectively, thereby indicating that the cysteine protease is a member of the alkaline protease group. The evaluation of substrate specificity indicated that the purified protease was more active towards Arg-X or Lys-X and did not efficiently cleave the substrates with non-polar amino acids at the P1 site. The PLCP evidenced fibrinolytic activity on the plasminogen-free fibrin plate test.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제31권3호
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• pp.216-223
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• 2003

새롭게 분리된 Bacillus cereus H-1으로부터 크기가 45-kDa인 chitosanase를 정제하여 특성을 파악하였고 1.3-kb의 chitosanase 유전자(choA)를 대장균에 클로닝하여 발현시켰다. H-1의 chitosanase 단백질(ChoA)은 ammonium sulfate 침전과 CM-sephadex칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 최적 pH는 약 7이었고 pH 안정성은 $50^{\circ}C$에서 4-11로 나타났다. 최적 온도는 약 5$0^{\circ}C$였으며 효소 활성은 $45^{\circ}C$ 아래에서 비교적 안정하였다. H-1 chitosanase는 soluble 또는 glycol chitosan뿐만아니라 carboxymethyl cellulose(CMC)에 대한 활성도 나타내었다. 정제된 ChoA의 MALDI-TOF MS분석에 기초하여 이미 알려진 다른 Bacillus chitosanases와의 데이터베이스 검색을 통해 전체 아미노산 서열을 밝혀내었다. Chitosanase gene에 해당하는 1.6 kb의 PCR 산물을 얻었으며 그의 DNA 서열을 결정하였다. choA의 추정 아미노산은 Bacillus sp. No 7-M과 Bacillus sp. KCTC0377BP의 아미노산과 98%의 유사성을 나타내었다. 재조합 ChoA단백질은 E. coli DH5$\alpha$에서 원 균주와 동일한 크기로 발현되었다. N말단의 추정아미노산서열을 다른 chitosanas리 서열과 비교해 볼때 ChoA는 chitosanase-cellulase 활성을 갖는 family 8에 속하는 미생물 endo-chitosanaseT. 추정되었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제34권1호
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• pp.40-46
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• 2006

단위 동물의 사료 내 phytate 인의 효율적 이용으로 배출되는 인의 양을 줄여 환경오염을 감소시키기 위해 phytate의 분해활성이 뛰어난 phytase 효소 분비 미생물을 탐색하기 위하며 우분으로부터 phytate 분해활성이 뛰어난 phytase를 생산하는 균주를 분리하였다. 분리균주를 동정한 결과, API 50 CHB test에 의해 B. circulans로 분류되었고, 16S rRNA sequencing 결과, B. subtilis로 동정되어 Bacillus sp. CF 5-26으로 명명하였다. 효소생산을 위한 최적배지 조성은 10% rice bran extract, 0.1%, whey protein powder, $0.01%\;CaCl_{2},\;0.01%\;KH_{2}PO_4$ 이었다. Bacillus sp. CF 5-26이 생산하는 phytase는 ethanol 침전, Sephadex G-100, CM Sepharose CL-6B, Sephacryl S-100-HR column chromatography를 통하여 정제도 20.3배, 수율 5.6% 정제되었고, SDS-PAGE에서 분자량 66 kDa의 단일 band를 확인하였다. 정제된 phytase는 pH 5.0, 7.0, 11.0에서 안정하였으며, $100^{\circ}C$에서 1시간 처리하였을 때 50%의 잔존활성을 보였다. 기질 특이성은 inositol polyphosphate인 sodium phytate 분해활성이 뛰어났으며, tripolyphosphate와 pyrophosphate에도 약간의 활성을 보였다. Bacillus sp. CF 5-26이 생산하는 phytase의 sodium phytate에 대한 Km은 0.64 mM 이었고, Vmax는 $4.41{\mu}mol/min$ 이었다.

• 생명과학회지
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• 제12권1호
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• pp.77-86
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• 2002

토양으로부터 chitinase를 생성하는 균주를 분리하여 동정한 결과 Bacillus subtilis로 판명되었으며, 분리한 균주를 Bacillus subtilis JK-56이라 명명하였다. B. subtilis JK-56의 chitinase 생산 최적 조건을 검토한 결과 1% chitin, 0.5% polypeptone, 0.1% KCI, 0.05% MnS $O_4$.4$H_2O$이며 초발 pH 7.0, 배양온도 37$^{\circ}C$에서 가장 많은 효소를 생산하였다. 본 균주가 생산하는 chitinase를 정제하기 위해서 native-PAGE를 이용해 효소활성 band를 확인한 결과, 1개의 강한 활성 band와 2개의 약한 활성 band를 가지는 isozyme으로 확인되었다. 확인된 isozyme을 정제한 결과, isozyme 중 1개의 강한 활성 band를 정제하였고 정제된 효소를 Chi-56A라고 명명하였다 Chi-56A의 효소 특성에 관해서 실험한 결과 분자량은 약 53kDa, pI는 4.3으로 확인되었다. 본 효소는 $65^{\circ}C$까지 상당히 안정하였으며 효소의 최대활성 온도도 $65^{\circ}C$로 확인되는 등 열에 대해 상당히 안정한 효소로 확인되었다. Collidal chitin에 대한 정제효소 Chi-56A의 $K_{m}$ 값은 17.33g/L였다. 그리고 pH 6.0에서 최대의 활성을 나타내었고, 산성범위보다 알칼리범위에서 안정한 것으로 나타났다. 또한 $Mn^{2+}$ 존재 하에서 높은 활성을 나타내었고 C $O^{2+}$와 $Mg^{2+}$ 존재 하에서도 활성이 약간 증가한 반면에 H $g^{2+}$ 존재 하에서는 상당한 저해를 받았다. Chito 올리고당에 대한 분해 산물을 HPLC로 확인해 본 결과 짝수개의 올리고당의 분해산물은 (GlcNAc)$_2$만을 생산하였고 홀수개의 올리고당에 대해서는 GlcNAc와 (GlcNAc)$_2$를 생산하는 것으로 비환원성 말단으로부터 이당체인 diacetyl chitobiose ((GlcNAc)$_2$)를 생산하는 exo형 chitinase로 추정 된다.

• 생명과학회지
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• 제20권5호
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• pp.683-690
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• 2010

효모 Saccharomyces diastaticus 는 세포 외로 분비되는 glucoamylase I, II, III 동위효소 중 하나를 생산하여 전분을 가수분해하여 포도당을 생성할 수 있다. Glucoamylase I, II, III는 STA1, STA2, STA3 유전자에 의해 각각 암호화된다. 효모 Saccharomyces 속이 포자가 형성되는 시기에 세포 내에서 특이적으로 발현된다고 알려진 glucoamylase (SGA)의 분자생물학적 및 생화학적 연구를 수행하기 위한 일환으로 S. diastaticus YIY 345 형질전환체의 배양 상등액으로부터 SGA 정제를 시도하였다. 황산암모늄 침전, DEAE-Sephadex A-50, CM-Sephadex C-50, Sephadex G-200 chromatography 등의 정제과정을 거쳐서 비특이 활성이 174배 증가된 0.22 mg의 순수한 SGA를 얻었다. HPLC와 SDS-PAGE 분석을 통해 이 효소는 63, 68 kDa의 단위체로 구성된 이합체임을 확인할 수 있었다. Con-A Sepharose 친화성 크로마토그피와 탈당쇄 효소를 처리한 결과로부터 SGA는 N-연결형 당쇄로 수식되었으며 단백질 부분은 59 kDa이었다. 정제한 SGA와 세포 외 분비성 glucoamylase의 효소학적 특성을 조사하고 비교한 결과 SGA의 최적 pH와 온도는 각각 5.5와 $45^{\circ}C$로 나타났으며 세포 외 분비성 glucoamylase는 5.0과 $50^{\circ}C$로 나타났다. SGA는 세포 외로 분비되는 glucoamylase에 비해 열처리 및 SDS에 대해 더 민감한 반응성을 나타내었다.

• 미생물학회지
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• 제32권4호
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• pp.285-290
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• 1994

자연계에서 새로운 제한효소 생산균을 검색하여 한 균주를 선발하고, 형태학적, 생리학적, 생화학적 특성들을 조사하여 Alcaligenes sp.로 동정하고 제한효소의 특성을 조사하였다. Alcaligenes sp. J-482가 생산하는 제한효소를 AspJI으로 명명하였다. AspJI은 pBR322, Adenovirus 2-DNA, ${lambda}$ DNA 등에 대한 절단양식이 AatII와 같아 AatII의 isoschizomer로 추정 되었으며, 효소활성에 12.5mM 이상의 $MgCl_2$를 필요로 하였으며, NaCl에 의하여 저해되었다. AspJI의 반응 최적 온도는 $37^{circ}C$, 최적 pH는 7.5로 확인 되었으며, 내열성을 조사한 결과 $85^{circ}C$이상에서 15분처리 할 때 안전히 실활되는 것으로 관찰되었다.

• 생명과학회지
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• 제27권7호
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• pp.849-856
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• 2017

역사적인 관점에서 ${\beta}$-D-fructofuranosidase (EC 3.2.1.26)는 1860년 프랑스 생물학자 Berthelot에 의해서 발견된 중요한 효소이며, 효소학을 연구하기 위해 처음 사용되었다. ${\beta}$-D-fructosfuranosidase는 sucrose가 D-glucose와 D-fructose로 가수 분해되는 것을 촉매 한다. 4 종류의 생화학 하위 그룹으로 나누어지는 ${\beta}$-D-fructofuranosidase가 식물에서 조사되었다. 정제 방법에 의해서 액상(수용성 산성), 세포질(가용성 알칼리), 막 결합(불용성 알칼리) 그리고 세포벽 결합(불용성 산성) ${\beta}$-D-fructosfuranosidase가 있다. 그들의 생화학적 특징은 뚜렷하다. 그것은 그 효소가 다른 유전자 산물일 가능성을 제시한다. 식물에서 자당을 분배하기 위한 이들 효소의 기여도는 위치한 장소와 상관 관계가 있는 것으로 보인다. 식물의 다양한 발달 단계 그리고 다양한 부분에서, 조직내의 세포를 발달시키는 공통적인 위치의 장소에 모든 동위효소들이 영양분 수송과 밀접하게 관련 되어 있음을 제시한다. ${\beta}$-D-fructosfuranosidase는 과일, 잎, 뿌리가 발달, 조직의 성숙 과 관련되어 가장 빈번하게 발견되었다. 그리고 ${\beta}$-D-fructosfuranosidase 활성은 세포 분열, 저장 기관 및 조직의 발달, 식물 방어 반응의 관계를 통해 성장과 확장 사이의 관계에 따라 그 활성의 차이가 다양하다. 명확한 생리 기능을 파악하기 위해서는 더 많은 연구를 종합 할 필요가 있다.