Phosphorylation upon protein is well known to a key regulator that implicates in modulating many cellular processes like growth, migration, and differentiation. Up to date, grafting of multidimensional separation techniques onto advanced mass spectrometry (MS) has emerged as a promising tool for figuring out the biological functions of phosphorylation in a cell. However, advanced MS-based phosphoproteomics is still challenging, due to its intrinsic issues, i.e., low stoichiometry, less susceptibility in positive ion mode, and low abundance in biological sample. To overcome these bottlenecks, diverse techniques (e.g., SCX, HILIC, ERLIC, IMAC, TiO2, etc.) are continuously developed for on-/off-line enrichment of phosphorylated protein (or peptide) from biological samples, thereby helping qualitative/quantitative determination of phosphorylated protein and its phosphorylated sites. In this review, we introduce to the overall views of enrichment tools that are universally used to selectively isolate targeted phosphorylated protein (or peptide) from ordinary ones before MS-based phospoproteomic analysis.
목 적 : 패브리병은 X-linked 지질 축적 질환으로 ${\alpha}$-galactosidase A (${\alpha}$-Gal A)의 결손으로 인해 스핑고당지질인 Gb3의 세포내 축적을 일으키는 병이다. 혈장 중 Gb3 측정은 패브리병 환자의 효소대체요법 후의 모니터링이나 진단에 임상적 의의가 크므로 ESI-MS/MS를 이용한 시료 전처리를 위한 노동력이 덜 들면서 간단, 신속, 고감도로 정량할 수 있는 혈장 중 Gb3분석법을 개발하고자 하였다. 방 법 : 혈장을 디옥산으로 50배 희석하여 vortex-mix 및 원심분리를 거쳐 Gb3의 추출 및 분리를 수행한다. 이 때 내부표준액인 C17:0 Gb3를 혈장에 처음부터 첨가한다. 희석과 원심분리된 혈장은 가드컬럼을 통하여 ESI-MS/MS의 다중성분 모니터링 모드에서 분석하여 내부표준액에 대한 8종 Gb3 isoform의 피크면적비를 이용하여 정량한다. 결 과 : 혈장의 바탕성분 하에서 8종의 Gb3 isoform이 완전히 잘 분리됨을 확인할 수 있었다. 혈장 중의 8종의 Gb3 isoform 중 50% 이상 차지하는 종류는 C16:0 Gb3 임이 확인되었다. Gb3 isoform이 직선성을 이루는 농도 범위는 0.001-1.0 ${\mu}g$/mL이었다. 검출한계(S/N=3)는 C16:0 Gb3의 경우 0.001 ${\mu}g$/mL 이었고 정량한계는 0.01 ${\mu}g$/mL 이었으며 회수율의 일내재현성(정확도 87-108%와 정밀도 7% 이하)과 일간재현성(정확도 87-110%와 정밀도 13% 이하)은 매우 양호 하였다. 결 론 : 본 연구에서 개발된 Gb3 분석법은 신속, 정확, 간편하게 패브리병의 1차 스크리닝이나 효소대체요법 전후의 모니터링 및 진단에 유용하게 적용될 수 있을 것이다.
Sohn, Ji Soo;Jung, Youngae;Han, Ji Soo;Hwang, Geum-Sook
한국자기공명학회논문지
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제22권2호
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pp.26-33
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2018
Xanthium sibiricum is used as a traditional folk medicine for the treatment of cancer, fever, headache, nasal sinusitis, and skin pruritus. This study aimed to identify components from Xanthium sibiricum extracts using an SPE-800MHz NMR-MS hyphenated system. The simultaneous acquisition of MS and NMR spectra from the same chromatographic peaks significantly increases the depth of information acquired for the compound and allows the elucidation of structures that would not be possible using MS or NMR data alone. LC -NMR analysis was conducted using a HPLC separation system coupled to 800 MHz spectrometer equipped with a cryoprobe, and a SPE unit was used to automatically trap chromatographic peaks using a HPLC pump. LC-MS analysis was conducted with a Q-TOF MS instrument using ESI ionization in the negative ion mode. Using the hyphenated analysis, several secondary metabolites were identified, such as 3',5'-O-dicaffeoylquinic acid, 1',5'-O-dicaffeoyl- quinic acid, and ethyl caffeate. These results demonstrate that the SPE-800MHz NMR-MS hyphenated system can be used to identify metabolites within natural products that have complex mixtures.
An isotope dilution-liquid chromatography/tandem mass spectrometric method was developed as a candidate reference method for the accurate determination of folic acid in infant milk formula. Sample was spiked with 13C5-folic acid and then extracted with phosphate buffer (pH 6) solution. The extract was further cleaned up by deproteinization followed by a C18 solid-phase extraction cartridge. The extract was analyzed by using LC/ ESI/MS/MS with selectively monitoring the collisionally induced dissociation channels of m/z 442 → m/z 295 and m/z 447 → m/z 295, which are the neutral glutamyl loss from the [M+H]+ ions of folic acid and 13C5-folic acid, respectively. LC/MS/MS chromatograms showed substantially reduced background from chemical noises compared to LC/MS chromatograms. Repeatability and reproducibility studies showed that the LC/MS/ MS method is a reliable and reproducible method which can provide less than 1.5 relative percentage of method precision.
Reversed-phase high-performance liquid chromatography/mass spectrometry (HPLC/MS) with an eletcrospray ionization (ESI) interface was applied to the identification of metabolites of IY81149 in the rat plasma. Fragments obtained using collision-induced dissociation (CID) in both positive and negative modes were utilized to elucidate the structure of metabolites. The eluent from the conventional HPLC column was split and directly introduced into an ESI-mass spectrometer for the identification of the structures. the CID technique allowed the sensitive identification of sulfonyl-IY81149 and hydroxy-IY81149 from the rat plasma.
인삼 모상근의 프로테옴 분석에 의해 얻은 질량분석 스펙트럼 데이터는 MALDI/TOF/MS에서 얻는 질량 스펙트럼과 ESI/Q-TOF/MS에서 얻는 탄뎀 질량 스펙트럼으로 구분된다. 질량 스펙트럼은 단백질이 효소에 의해 분해된 펩타이드들의 분자량 정보를 제공하며, 탄뎀 질량 스펙트럼에서는 아미노산 단위로 분해된 절편 단백질의 분자량으로부터 아미노산 서열을 결과로 얻는다. 펩타이드의 아미노산 서열을 BLAST로 검색하면 유사한 단백질을 GenBank에서 검색할 수 있다. 이러한 단백질 동정 방법은 완전한 유전체 서열이 알려진 생물체의 경우 높은 정확도로 단백질을 동정할 수 있으나, 그렇지 않은 경우는 유사한 단백질이 데이터베이스에 존재하지 않아 분석이 용이하지 않다. 본 연구에서는 질량 스펙트럼 및 절편 단백질의 아미노산 서열을 EST (expressed sequence tag) 서열과 비교하여 프로테옴 데이터와 일치하는 EST 서열을 찾아내고 이를 BLAST검색에 의해 단백질 동정에 활용하였다. ESI/Q-TOF/MS 에서 얻은 아미노산 서열은 길이는 짧지만 데이터의 신뢰도가 높으므로 EST 서열과의 연관 관계를 밝힘으로써 단백질에 대한 정보를 보완할 수 있었다. ESI/Q-TOF/MS에서 얻은 펩타이드의 아미노산 서열을 EST 서열과 비교한 결과 90%의 아미노산 서열이 EST DB에서 발견되었다. NCBI의 nr 데이터베이스에서 아미노산 서열을 검색하여 찾은 단백질이 68%임에 비하여, 인삼 EST 서열에 의한 검색이 22% 더 많은 결과를 얻었다. MALDI/TOF/MS의 질량 스펙트럼에서 nr 데이터베이스로 검색한 결과와 인삼 EST 데이터베이스를 검색한 결과가 일치하는 경우는 47개 중 9개인 19%에 불과하여, 탄뎀 질량 분석으로 아미노산 서열을 얻지 않고, 단지 질량 스펙트럼으로부터 단백질을 동정하는 방법으로는 단백질 동정의 정확한 결과를 기대하기 어려움을 확인하였다.
Collision-induced dissociation (CID) combined with electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS) was used to obtain structural information on rat islet amyloid polypeptide (rIAPP) monomers (M) and dimers (D) observed in the multiply charged state in the MS spectrum. MS/MS analysis indicated that the rIAPP monomers adopt distinct structures depending on the molecular ion charge state. Peptide bond dissociation between L27 and P28 was observed in the MS/MS spectra of rIAPP monomers, regardless of the monomer molecular ion charge state. MS/MS analysis of the dimers indicated that D5+ comprised M2+ and M3+ subunits, and that the peptide bond dissociation process between the L27 and P28 residues of the monomer subunit was also maintained. The observation of (M+ b27)4+ and (M+ y10)3+ fragment ions were deduced to originate from the two different D5+ complex geometries, the N-terminal and C-terminal interaction geometries, respectively. The fragmentation pattern of the [MrIAPP + MhIAPP]5+ MS/MS spectrum showed that the interaction occurred between the two N-terminal regions of MrIAPP and MhIAPP in the heterogeneous dimer (hetero-dimer) D5+ structure.
본 연구에서는 LC/ESI/MS 및 GC/MS로 superdrol을 인체에 경구투여 한 후 채취한 요시료 중에 함유된 superdrol 및 그 대사체의 분석법을 확립하고 이들의 체내 배설형태를 조사하였다. 액체-액체 추출에서 최적 추출 pH는 6.5 이고 최적 추출 용매는 diethly ether이였다. GC/MSD를 이용하여 superdrol과 그 대사체의 분석법에 대한 유효성을 점검한 결과, intra-day의 회수율은 89.7-113.2%, 정확도 91.8-113.8%, 재현성은 0.2-6.8%로 나타났고 inter-day의 회수율은 89.3-104.1%, 정확도는 95.2-103.0%, 재현성은 0.7-7.8%로 나타났다. LC/ESI/MS을 통해 얻은 blank urine과 dosed urine의 크로마토그램을 비교하여 superdrol의 대사체를 검출하였으며 Superdrol과 그 대사체를 유도체화 시켜 GC/TOF-MS로 확인하였다. 확보된 질량스펙트럼으로부터 superdrol M1의 경우 superdrol의 3-C 위치의 케톤기가 하이드록시기로 환원된 것으로 추정할 수 있었고 M2의 경우 superdrol의 D-ring에 하이드록시기가 첨가된 것으로 추정할 수 있었다. 또한, 효소가수분해과정을 비교해 본 결과 superdrol과 그 대사체들은 대부분 글루쿠론산 포합체를 형성하여 체외로 배설되는 것을 확인하였다. Superdrol 경구투여 후 채취한 요시료로부터 superdrol과 그 대사체의 배설양상을 조사한 결과, 모두 4.3 시간에서 최대배설량을 보였고 superdrol과 superdrol M1은 48시간까지도 미량검출 되어 체내 잔류성이 높은 물질임을 확인할 수 있었다.
유도결합 플라스마 질량분석기(ICP-MS)와 유도결합 플라스마 원자방출분광기 (ICP-AES)를 이용하여 상업적으로 유통되고 있는 4 종의 분무기(Meinhard, ESI PFA, Cross-flow, Babington)와 한국표준과학연구원(KRISS)에서 직접 제작한 분무기인 KRISS Inert 분무기와 KRISS conespray 분무기의 성능을 평가하였다. 각 분무기의 압력, 시료주입량의 변화에 따른 시료주입 효율을 조사하였으며 ICP-MS와 ICP-AES에 연결하였을 때 시료주입량의 변화에 따른 감도, 안정성, 바탕선 세기, 산화물과 수소화물의 생성 비율을 조사하였다. 시료의 종류, 시료 양의 제한성, 분석기기의 종류, 분석 원소에 따라 가장 적합한 분무기를 선택해야 높은 감도, 낮은 바탕값, 안정한 신호세기 등의 좋은 분석결과를 얻을 수 있음을 알 수 있었다.
Zhihong Yin;Zhisheng Ma;Siting Wang;Shitong Hao;Xinyou Liu;Quanhai Pang;Xinzhuang Wang
Animal Bioscience
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제36권9호
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pp.1367-1375
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2023
Objective: Pigment production and distribution are controlled through multiple proteins, resulting in different coat color phenotypes of sheep. Methods: The expression distribution of vimentin (VIM) and transthyretin (TTR) in white and black sheep skins was detected by liquid chromatography-electrospray ionization tandem MS (LC-ESI-MS/MS), gene ontology (GO) statistics, immunohistochemistry, Western blot, and quantitative real time polymerase chain reaction (qRT-PCR) to evaluate their role in the coat color formation of sheep. Results: LC-ESI-MS/MS results showed VIM and TTR proteins in white and black skin tissues of sheep. Meanwhile, GO functional annotation analysis suggested that VIM and TTR proteins were mainly concentrated in cellular components and biological process, respectively. Further research confirmed that VIM and TTR proteins were expressed at significantly higher levels in black sheep skins than in white sheep skins by Western blot, respectively. Immunohistochemistry notably detected VIM and TTR in hair follicle, dermal papilla, and outer root sheath of white and black sheep skins. qRT-PCR results also revealed that the expression of VIM and TTR mRNAs was higher in black sheep skins than in white sheep skins. Conclusion: The expression of VIM and TTR were higher in black sheep skins than in white sheep skins and the transcription and translation were unanimous in this study. VIM and TTR proteins were expressed in hair follicles of white and black sheep skins. These results suggested that VIM and TTR were involved in the coat color formation of sheep.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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