• 환경생물
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• 제39권4호
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• pp.445-451
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• 2021

Agrobacterium tumefaciens strain CP4 유래 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSPS) 유전자를 포함하는 유전자변형생물체(Living modified organism, LMO)가 개발되었다. 이 같은 LMO는 국내 승인되어 사료용, 식품용, 가공용으로 이용 중이다. 간이면역 검사키트 개발을 위해서는 고효율의 단클론 항체 개발이 필수적이다. 본 연구에서는 대장균 BL21 (DE3)에서 재조합 CP4 EPSPS 단백질을 정제하였으며 SDS-PAGE와 MALDI-TOF MS 분석으로 단백질 특성을 분석하였다. 단클론 항체 제작은 (주)앱클론의 SOP 매뉴얼에 따라 진행하였다. 본 연구 결과 5개의 단클론 항체 클론(2F2, 4B9, 6C11, 10A9, 10G9)를 확보하였다. 5종의 단클론 항체의 효율과 특이도 검정을 위해서 LM 면화 추출액을 이용한 western blotting 분석을 실시하였다. 모든 단클론 항체는 CP4 EPSPS를 함유하는 MON1445와 MON88913을 특이적으로 검출하였으며 비변형 면화 및 타종의 LM 면화에서는 검출되지 않았다. 이러한 결과들을 바탕으로 CP4 EPSPS 단클론 항체는 LMO에 함유된 CP4 EPSPS 단백질을 타겟으로 항체 기반 검출법 개발에 활용될 것으로 사료된다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제50권2호
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• pp.235-239
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• 2022

Psychrophiles have evolved to produce cold-adapted enzymes to enable survival in low-temperature environments. In this study, the cold adaptation of 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (CpsEPSPS) from Colwellia psychrerythraea, a model psychrophile, was analyzed. The optimum temperature for the activity of CpsEPSPS was found to be 25℃, with 35% activity remaining at 5℃. However, the unfolding temperature of CpsEPSPS was 54℃. This phenomenon is frequently observed in cold-active enzymes. As is the cases for most cold-active enzymes, the K_m values of CpsEPSPS for its substrates were higher than those of Escherichia coli EPSPS. These results indicate that CpsEPSPS is cold-adapted, but not perfectly.

• 원예과학기술지
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• 제28권4호
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• pp.648-655
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• 2010

본 연구에서는 들잔디와 돌연변이체에서 Glyphosate 내성 관련 유전자인 EPSPS를 코딩하는 cDNA를 분리하여, 시퀸스 비교분석과 발현 양상 차이 등에 관하여 조사하였다. 5'/3' RACE를 통하여 밝혀진 EPSPS의 cDNA는 각각 1176bp의 open reading frame으로 이루어져 있으며 391개의 아미노산을 코딩하고 있었다. 이는 보고된 다른 EPSPS 유전자들과 높은 유사성을 가지고 있다. Genomic southern 결과 들잔디 내에 EPSPS 유전자는 단일copy로 존재하였다. Wild type과 제초제 내성 변이체의 EPSPS 유전자는 6개의 아미노산 시퀀스의 차이를 보였으며 기존에 보고된 EPSPS active site에서 시퀀스의 차이를 나타냈다. 한편 glyphosate의 독성기작의 하나인 EPSPS 효소활성 저해 작용을 알아본 결과, 내성 개체에서 높은(1.5배 이상) EPSPS 활성을 확인할 수 있었다. Northern 분석과 RT-PCR로 제초제 처리 시간에 따른 EPSPS의 발현량을 살펴본 결과, 제초제 처리 후 시간이 경과할수록 발현량이 증가하다가 7일 이후에는 감소하였고, wild type에 비해 glyphosate 내성 선발개체에서 전체적인 발현량이 높음을 알 수 있었다. 본 연구 결과 선발된 glyphosate 내성 돌연변이체는 높은 EPSPS 효소활성 증가 및 EPSPS active site의 아미노산 시퀀스 변화를 통해 원할하고 지속적인 방향족 아미노산의 합성이 가능한 것으로 보여졌다. 본 실험을 통해 얻어진 glyphosate 내성 잔디 돌연변이체와 방법은 앞으로 유용한 제초제 저항성 돌연변이 품종개발 연구에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제38권4호
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• pp.272-277
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• 2011

Plants expressing Agrobacterium sp. strain CP4 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (CP4 EPSPS) are known to be resistant to glyphosate, a potent herbicide that inhibits the activity of the endogenous plant EPSPS. In order to develop herbicide-resistant rice, we prepared transgenic rice plants with CP4 EPSPS gene under the control of CaMV 35S promoter for over-expression. A recombinant plasmid was transformed into rice via Agrobacterium-mediated transformation. A large number of transgenic rice plants were obtained with glyphosate and most of the transformants showed fertile. The integration and expression of CP4 EPSPS gene from regenerated plants was analyzed by Southern and northern blot analysis. The transgenic rice plants had CP4 EPSPS enzyme activity levels more than 15-fold higher than the wild-type plants. EPSPS enzyme activity of transgenic rice plants was also identified by strip-test method. Field trial of transgenic rice plants further confirmed that they can be selectively survived at 100% by spay of glyphosate (Roundup$^{(R)}$) at a regular dose used for conventional rice weed control.

• 한국식품과학회지
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• 제36권3호
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• pp.369-374
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• 2004

유전자재조합 콩 Roundup Ready는 Agrobacterium sp. CP4에서 유래한 유전자를 함유하고 있으며 이 삽입 유전자에서 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase(CP4EPSPS)가 발현된다. 본 연구실에서는 이 단백질을 유전자재조합 콩과 시중에서 구입한 두부 시료에서 CP4EPSPS 특이 단클론 및 다클론 항체를 이용하여 immunoblotting법으로 검사하였다. 분리 정제된 CP4EPSPS 재조합 단백질은 단클론 또는 다클론 항체를 이용할 때 각각 $0.006{\mu}g$ 또는 $0.0006{\mu}g$의 검증 한계치로 확인할 수 있었다. 유전자재조합 콩에 발현된 CP4EPSPS 검증 한계치는 단클론 또는 다클론 항체를 이용할 때 각각 $0.001{\mu}g$과 $0.0001{\mu}g$이었다. 다클론 항체를 이용하여 조사된 9종의 두부에서는 2종에서 양성결과를 확인하였다. 본 연구에서 생산된 단클론 및 다클론 항체를 이용하여 확립된 immunoblotting법은 콩 가공식품 중의 glyphosate 내성 유전자재조합 콩 검사에 적용될 수 있을 것이다.

• 한국식품영양과학회지
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• 제41권9호
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• pp.1310-1314
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• 2012

본 실험은 제초제 내성을 가지는 CP4EPSPS를 도입시킨 유전자재조합 콩을 이용하여 인공위액의 비율에 따른 도입 단백질의 소화특성을 평가하고, 열처리가 유전자재조합 콩의 도입단백질의 소화성에 미치는 영향을 살펴보았다. 유전자재조합 콩과 펩신의 비율에 따른 도입단백질 CP4EPSPS의 소화성은 인공위액 즉 펩신의 양에 따라 차이를 나타내 유전자재조합 식품의 도입단백질에 대한 소화성 평가에서 펩신의 양이 중요한 요인이 됨을 알 수 있었다. 또한 유전자 재조합 콩에 대한 예열처리가 도입단백질 CP4EPSPS의 펩신에 대한 내성을 많이 감소시켜 소화성을 높이는 것으로 나타났다. 따라서 앞으로 유전자재조합식품의 안전성을 평가하는 in vitro 소화평가 시험에서 생리학적 측면에 근거한 인공위액의 비율을 반영함으로써 보다 정확한 도입단백질의 소화성에 대한 평가가 필요하리라 사료되며, 또한 콩의 주요 섭취방법인 열처리에 따른 도입단백질의 소화특성을 평가함으로써 유전자재조합 콩의 안전성에 대한 신뢰도 제고를 위한 기초자료가 될 것으로 기대된다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제16권1호
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• pp.25-31
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• 2006

Changes of CP4 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (CP4 EPSPS) in the glyphosate-tolerant Roundup Ready soybean were examined using purified CP4 EPSPS produced in cloned Escherichia coli as a control. CP4 EPSPS in genetically modified soybean was detected by twodimensional gel electrophoresis (2-DE) and identified by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) with databases. CP4 EPSPS in soybean products was resolved on 2-DE by first isoelectric focusing (IEF) based on its characteristic pI of 5.1, followed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) based on its molecular mass of 47.5 kDa. We quantified various percentages of soybean CP4 EPSPS. The quantitative analysis was performed using a 2D software program on artificial gels with spots varying in Gaussian volumes. These results suggested that 2-DE image analysis could be used for quantitative detection of GM soybean, unlike Western blotting.

• 식물조직배양학회지
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• 제24권6호
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• pp.341-344
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• 1997

알팔파의 자엽과 하배축을 배양하여 캘러스를 유기하고 이들을 glyphosate첨가 액체배지에서 배양하여 glyphosate에 대한 생장억제 반응을 검사하였으며 10 mM glyphosate에 저항성인 세포주를 선발하고 EPSPS 활성을 조사 하였던 바 캘러스 유기율은 2,4-D 1 mg/L, kinetin 0.5 mg/L에서 가장 높았고 자엽보다 하배축이 캘러스 유기율이 높았으며, glyphosate 농도에 대한 ID$_{50}$은 0.1 mM과 0.2 mM사이에 있었다. A49-10G와 A58-10G는 대조세포주에 비해 각각 8.0배 와 9.1배의 높은 EPSPS 활성을 보였다.

• 한국식품과학회지
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• 제35권4호
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• pp.556-560
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• 2003

CP4 EPSPS에 대한 특이항체(다클론 및 단클론)을 이용하여 확립한 전보의 sandwich ELISA 분석법을 원료 콩의 GMO 분석에 적용가능한 가를 검토하였다. 원료 콩은 수입산 47점, 국산 20점을 분석하였다. 그 결과, 수입산 콩의 CP4 EPSPS 분석치는 크게 두 군으로 나뉘어 높은 군$(39.1{\pm}13.5{\mu}g/g,\;n=33)$과 낮은 군$(2.6{\pm}1.2{\mu}g/g,\;n=14)$으로 나타났다. 수입산 콩의 GMO 비율은 약 70.2%로 나타났다. 한편, 국산 콩의 CP4 EPSPS의 함량 $(0.9{\pm}0.5{\mu}g/g,\;n=20)$은 아주 낮은 것으로 나타났고 이는 non-GMO인 것으로 판단되었다. 콩나물의 경우에 GM과 non-GM 간 CP4 EPSPS의 차이를 보이고 있었고 GM 콩나물의 자엽부에서 뿌리보다 높은 CP4 EPSPS의 함량을 보여주고 있다. 국산 콩으로 만든 콩나물의 경우 CP4 EPSPS의 함량은 아주 낮은 것으로 나타나 GM과 non-GM 콩간의 구분이 가능하였다. 또한 PCR에 의해 sandwich ELISA가 정확하다는 것을 보여주었다. 이상과 같이 sandwich ELISA 방법은 신속, 간편하게 많은 콩 시료의 GMO 여부를 판단할 수 있음을 보여주었다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제14권2호
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• pp.390-394
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• 2004

The genetically modified glyphosate-tolerant soybean contains the following introduced DNA sequences: the EPSPS (5-enol-pyruvylshikimate-3-phosphate synthase) gene from Agrobacterium sp. strain CP4, the 35S promoter from the cauliflower mosaic virus, and the NOS terminator from Agrobacterium tumefaciens. In the present study, detection of these introduced DNAs was performed by amplification using the polymerase chain reaction (PCR). A multiplex PCR method was also applied to prevent false positive results. When primers for 35S promoter, nos3', CTP(chloroplast transit peptide), and CP4 EPSPS (EPSPS from Agrobacterium sp. CP4) were used, positive results were obtained in PCR reactions using DNA from genetically modified glyphosate-tolerant soybeans. There were no false positive results when using DNA from non-genetically modified soybeans. The CP4 EPSPS gene was detected when less than 125 pg glyphosate-tolerant soybean DNA was amplified. Lectin Lel and psb A were amplified from both non-genetically modified and genetically modified glyphosate-tolerant soybean DNA. Multiplex PCR was performed using different primer sets for actin Sacl, 35S promoter and CP4 EPSPS. The actin gene was detectable in both non-genetically modified and glyphosate-tolerant soybeans as a constant endogenous gene. Target DNAs for the 35S promoter, and CP4 EPSPS were detected in samples containing 0.01-0.1% glyphosate-tolerant soybean, although there were variations depending on primers by multiplex PCR. Soybean seeds from five plants of non-genetically modified soybean were co-cultivated for six months with those of genetically modified soybean, and they were analyzed by PCR. As a result, they were not positive for 35S promoter, nos3' or CP4 EPSPS. Therefore, these results suggest there was no natural crossing of genes between glyphosate-tolerant and non-genetically modified soybean during co-cultivation, which indicates that gene transfer between these plants is unlikely to occur in nature.