• 생명과학회지
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• 제28권9호
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• pp.1062-1067
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• 2018

국제 무역 및 전세계 수산물 소비의 증가로 인해 다양한 수산물이 국내로 수입되어 유통되고 있다. 최근 수입 수산물의 종명 및 원산지 표시사항을 허위로 기재하는 경우가 급증하여 식품안전성에 심각한 문제가 야기되고 있다. 불법적으로 유통되는 수산물의 안전관리를 위해 DNA 기반 기술을 이용한 종 판별법 마련이 시급하다. 본 연구에서는 전세계적으로 중요한 대형선망어업 어종 중 하나인 전갱이속 어류의 종을 판별하기 위해 duplex-PCR을 사용한 검출 방법을 개발하였다. 국내에 유통되는 T. japonicus과 T. novaezelandiae의 시료를 확보하여 COI 영역의 염기서열 분석을 통하여 종간 특이성을 나타내는 단일염기다형성 유전자를 탐색하였으며, PCR 증폭 산물의 크기를 고려하여 2개의 종 특이적인 정방향 primer를 설계하였다. Duplex-PCR 분석 결과, T. japonicus (103 bp), T. novaezelandiae (214 bp)와 같은 단일 밴드를 전기영동상에서 확인 할 수 있었으며 상호간의 비 특이적 밴드는 형성되지 않았다. 또한 duplex-PCR 방법을 통한 T. japonicus과 T. novaezelandiae에서 최저 $0.01ng/{\mu}l$까지 검출됨을 확인 할 수 있었다. 따라서 본 연구에서 개발된 duplex-PCR 분석법을 이용한 전갱이속 어류의 종 판별법은 정확도와 민감도가 우수하여 수산물의 수출입 및 시중에 불법적으로 유통 가능성이 있는 제품을 신속하고 과학적으로 판별할 수 있어 수산물안전관리에 활용도가 매우 클 것으로 기대된다.

• 한국산림과학회지
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• 제104권4호
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• pp.549-557
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• 2015

본 연구에서는 잣나무 엽록체 DNA의 전체 염기서열을 기반으로 엽록체 SSR(chloroplast simple sequence repeat) 영역을 특이적으로 증폭하는 primer를 개발하고 그 특성을 분석하였다. 잣나무 엽록체 DNA에서 총 30개의 SSR 영역을 탐색하였으며, 이들 영역을 증폭하기 위한 30개의 primer를 제작하였다. 모든 primer가 잣나무를 대상으로 PCR 증폭이 가능하였다. 근연종에 대한 primer의 종간 전환률은 잣나무와 동일한 아속(Subgenus Strobus)에 속하는 눈잣나무(100%)와 섬잣나무(97%)에서 가장 높게 나타났다. 반면 소나무아속(Subgenus Pinus)에 속하는 소나무와 구주소나무에서의 종간 전환률은 73%로 비교적 낮게 나타났다. 점봉산 잣나무 집단을 대상으로 조사한 결과 13개의 유전자좌에서 다형성이 관찰되었으며, 평균 haploid 다양도(H)는 0.512로 계산되었다. 다형적 유전자좌로부터 조합된 haplotype의 수(N)는 25개로 확인되었고, haplotype 다양도($H_e$)는 0.992로 매우 높게 나타났다. 집단내 독특하게 관찰되는 haplotype은 22개(88%)로 전체 28개체 중에서 22개체(79%)를 식별하였다. 본 연구에서 개발한 cpSSR primer는 높은 종간 전환률을 나타냄에 따라 소나무속의 근연종, 특히 잣나무아속 수종에 활용 가능성이 높고, 잣나무 유전변이 분석을 위한 충분한 다형성을 제공하는 유용한 표지자로 판단된다.

• 미생물학회지
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• 제36권4호
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• pp.273-278
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• 2000

1996년 1월부터 1998년 12월까지 주암호의 한 정점에서 12개의 시료를 채수하여 총 세균의 DNA를 추출한 뒤 DNA 중에 gentamicin 저항성에 관련된 aminoglycoside acetyltransferase들의 유전자의 aacC들 (aacC1∼aacC4)과 Aeromonas 속이 생산하는 독소인 aerolysin 유전자의 존재 여부를 PCR을 통해 확인하였다. 전체 12개의 DNA 시료중 9개의 시료에서 aacC2 유전자가 검출되었고, aacC2 유전자가 검출된 시료 중 7개의 시료에서 aacC2 유전자가 Tn3의 염기서열과 연관되어 발현이 증가되는 구조를 하고 있었다. 그러나 aacC1, aacC3 및 aacC4 유전자는 검출되지 않았다. Aeromonas 속에서 보고된 aerolysin과 hemolysin 등의 유전자에서 conserved region을 찾아내어 aerolysin 유전자의 검출을 위한 PCR primer set를 설계하였다. 설계된 primer set는 12개의 DNA 시료 중 7개의 시료에서 예상된 414 bp의 PCR 산물을 증폭하였다. 이 DNA 절편을 probe로 사용하여 Southern hybridization을 행한 결과 12개의 DNA 시료 중 10개의 시료에서 aerolysin 유전자가 검출되었다. 그러나 이들 유전자의 계절에 따른 출현의 변화는 발견되지 않았다.

• 한국균학회지
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• 제38권1호
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• pp.34-39
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• 2010

느티만가닥버섯의 품종구분을 위하여 국내 버섯보존기관으로부터 수집한 30종의 품종에 대한 RAPD 분석을 실시하였다. 이를 위하여 고체배지상의 균사로부터 염색체 DNA를 분리하였고 이를 주형으로 하여 3개의 random primer로 PCR 반응을 수행하였다. 그 결과 각 PCR 반응에서 200 bp에서 3000 bp 범위의 크기를 가진 DNA 밴드 약 30종이 관찰되었다. DNA 밴드 패턴은 UPGMA 방법으로 분석하여 그 결과를 dentrogram으로 나타내었다. 느티만가닥버섯은 2개의 클러스터로 분석되었으며, 클러스터 1은 다시 3개의 작은 그룹으로 나눌 수 있었다. 반면, 클러스터 2의 경우에는 유전적으로 클러스터 1보다 다양한 품종으로 구성되어 있었다. 흥미롭게도 덕유산에서 채집된 야생종 Hm3-10의 경우 어느 클러스터에도 속하지 않는 고유의 품종임을 확인하였다. RAPD 결과 나타나는 품종별 고유의 DNA 밴드를 품종특이적 마커로 개발하기 위하여, Hm0-4 품종의 250 bp 특이밴드를 TA-클로닝하고 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열을 바탕으로 PCR primer를 디자인하였고 이를 이용하여 PCR 반응을 수행하였다. 그 결과 250 bp DNA 밴드는 Hm0-4 품종에서만 관찰되었으며 이는 이러한 접근법이 품종특이적 마커개발에 잘 적용됨을 보여주는 것이다.

• KSBB Journal
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• 제22권5호
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• pp.362-365
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• 2007

Cyanobacterial A-domain의 A3 motif와 A7 motif의 높은 진화론적 보존성에 의거해서 Non-ribosomal peitides를 생산하는 시아노박테리아를 Screening할 수 있는 degenerated primer를 만들 수 있었다. Degenerate primer서열의 종류는 가능하면 1,000개 정도까지를 기준으로 만드는 것이 좋다. Primer의 종류가 너무 많으면 primer 1종류 당 mol수가 적게 되어 특이성도 저하된다. 그러므로 Primer의 종류가 많을 경우는 inosin을 N (4종류의 염기) 부분에 이용하면 어느 염기에도 강하게 결합하지 않고 두 가닥 DNA 형성을 저해하지도 않으므로 degeneration을 줄이는데 도움이 된다. Degenerate primer의 annealing 온도는 primer에 포함되어있는 서열 중 가장 낮은 Tm을 기준으로 한다. 이번 연구처럼 N (ACGT) 대신에 Inosin을 이용하였을 때에는 Inosin이 Tm을 높게 하지 않고 Tm을 낮게 하지도 않으므로 Tm 계산시 고려하지 않아도 되었다. PCR 효율이 떨어질 우려가 있으므로 충분한 Tm값 (대개 $45\sim60^{\circ}C$ 이상)을 갖는 서열을 디자인하여 primer로 PCR하는 것이 좋지만, A3/A7 degenerate prime에서는 실험에 의해 40$^{\circ}C$로 annealing 온도가 (Tm) 다소 낮게 설정되었다. 그러므로 검출되지 않은 NRPS gene을 가진 균주와 CBT635, CBT654와 같이 약한 PCR band의 형성은 새로 제작된 primer의 낮은 Tm 기인한다고 생각되어진다. Tm의 이론적인 값은 Tm ={(G+C)*4+(A+T)*2}의 식을 통해서 정방향 primer에서 54$^{\circ}C$ 역방향 primer에서 42$^{\circ}C$로 계산되었다. 새로운 degenerate primer에 의해서 MTF2/MTR2로 검출되지 않는 6개의 균주가 더 검출되었으며, A3/A7과 MTF2/MTR2를 이용한 통합 PCR Screening을 통해서 NRPS gene 검출에 특이성과 효율성을 높일 수 있다.

• 대한수의학회지
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• 제41권3호
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• pp.357-365
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• 2001

This study was performed to detect the Salmonella genus-specific DNA marker for comparing of polymophisms between S pullorum and S gallinarum by using PCR amplified techniques. A total of ten primers were used to detect DNA polymorphisms from S pullorum and S gallinarum. The number of DAF bands detected per each primer varied from 26 to 45, with an average of 32.7 using 10 primers. A total of 327 DAF bands were generated and among them 123 bands were polymorphic(37.6%). These DNA amplified fingerprinting(DAF) specific bands for S pullorum and S gallinarum were observed from all primers. For S pullorum, GEN 60-04, GEN 70-04 and GEN 70-03 primers showed a high level of polymorphism with 0.79, 0.70 and 0.57, respectively. But GEN 60-05 primer did not show a level of polymorphism. For S gallinarum, GEN 70-03, 60-04, 60-07, 70-05 and 70-04 primers showed a higher a low level of polymorphism from 0.16 to 0.28. Each five strains of S pullorum and S gallinarum were isolated from chickens showed typical clinical signs related with infection of pullorum disease or fowl typhoid at commercial chicken farms. DNA markers of these strains produced by GEN 70-04, GEN 70-05 and GEN 70-08 showed significant difference of band patterns between S pullorum and S gallinarum. These DNA markers could be used for comparison of DNA marker polymorphism between S pullorum and S gallinarum as well as rapid diagnosis of fowl typhoid and pullorum disease of domestic fowls.

• 생명과학회지
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• 제13권5호
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• pp.699-704
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• 2003

리스테리아를 보다 효과적으로 typing할 수 있는 방법을 찾기 위해 표준균주 13종을 대상으로 하여 RAPD, ERIC (Enterobacterial repetitive intergenic consensus) fingerprinting, ribotyping-PCR의 분리력을 비교해 보았다. DG107 (primer 6) 또는 DG122 (Lis 11) primer를 이용한 RAPD의 경우 11가지의 유형으로 분류되는 반면, ERIC fingerprinting은 9가지, ribotyping-PCR은 7가지씩의 유형을 보였다. 그러나 2가지 primer를 이용하여 각각 행한 RAPD 결과를 종합하거나, DG122를 이용한 RAPD와 ribotyping-PCR의 결과를 종합할 경우 13가지의 유형으로 모두 분리할 수 있었다.

• Plant Resources
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• 제5권3호
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• pp.169-175
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• 2002

The soybean cyst nematode (Heterodera glycines Inchinoe; SCN) is a devastating pest of soybean and is responsible for significant losses in yield. The use of resistant cultivars is the effective method to reduce or eliminate SCN damage. The objective of this research is to identify AFLP markers linked to the SCN resistant genes. Bulked genomic DNA was made from resistant and susceptible genotypes to SCN and a total of 19 primer combinations were used. About 31 fragments were detected per primer combination. The banding patterns were readily distinguished in resistant and susceptible bulked genotypes. Polymorphic fragments were detected between resistant and susceptible bulked genotypes in the primer combination of CGT/GGC, CAG/GTG and CTC/GAG. In primer combinations of CGT/GGC and CAG/GTG, bulked resistant genotype produced a polymorphic bands. However, in primer of CTC/GAG, bulked susceptible genotype produced a polymorphic fragments. Three AFLP markers identified as a polymorphic fragments between bulked genomic DNA were mapped in 85 F2 population. Among them, only two markers, CGT/GGC and CTC/GAG, was linked and was mapped. Broad application of AFLP marker would be possible for improving resistant cultivars to SCN.

• 한국수정란이식학회지
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• 제11권3호
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• pp.283-289
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• 1996

This study was carried out to determine the sex of genomic and embryonic DNA using polymerase chain reaction(PCR). Bovine specific(216bp) and Y chromosome speicific DNA primers(l4lbp) were synthesized and tested for sexing. Bovine embryos used in this study were produced by in vitro fertilization. Few blastomeres for PCR were bisected by nicromanipulator and demi -embryos were cultured in TCM 199 medium containing 0.1% of solcoseryl. The results obtained were as follows; 1. Average optical density of genomic DNA extracted from blood of Hanwoo was 1.79$\pm$ 0.14. 2. 2. The ratio of the demi-embryos developed to blastocyst was 62.1 and 81.9% in morula and blastocyst, respectively. 3. When DNA of 2~4, 5~10 and more than 11 blastomeres was amplified with Y chromosome specific DNA primer by PCR, appreance rate of Y specific DNA band was 16.7, 46.2 and 40.0%, respectively. At least 5 to 10 blastomeres were required to determine the sex of embryos. 4. The rate of demi-embryos developed to blastocyst was 73.3% in TCM 199 medium supplemented with 0.1% solcoceryl. but 55.6% in control.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제12권1호
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• pp.166-171
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• 2002

The genus Leuconostoc is generally recognized as a favorable microorganism associated with a good taste of Kimchi and Lactobacillus plantarum is responsible for the overripening and acidification of Kimchi. A rapid and reliable PCR-based method to monitor the change of these lactic acid bacterial populations during Kimchi fermentation was attempted. A Leuconostoc-specific primer set was chosen from the conserved sequences of 16S rRNA genes among Leuconostoc species. The Lb. plantarum-specific primer set was the internal segments of a Lb. plantarum-specific probe which was isolated after randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis and tested for identification. The specificity of this protocol was examined in DNA samples isolated from a single strain. In agarose gel, as little as 10 pg of template DNA could be used to visualize the PCR products, and quantitative determination was possible at the levels of 10 pg to 100 ng template DNA. For the semi-quantitative determination of microbial changes during Kimchi fermentation, total DNAs from the 2 h-cultured microflora of Kimchi were extracted for 16 days and equal amounts of DNA templates were used for PCR. The intensities of DNA bands obtained from PCR using Leuconostoc-specific and Lb. plantarum-specific primer sets marked a dramatic contrast at the 1 ng and 100 ng template DNA levels during Kimchi fermentation, respectively. As the fermentation proceeded, the intensity of the band for Leuconostoc species increased sharply until the 5th day and the levels was maintained until the 11 th day. The sharp increase for Lb. plantarum occurred after 11 days with the decrease of Leuconostoc species. The results of this study indicate that Leuconostoc species were the major microorganisms at the beginning of Kimchi fermentation and reach their highest population during the optimum ripening period of Kimchi.