독성이 있는 특이한 편모충인 Alexandrium tamarense의 구별하기 위한 종특이적인 형광 DNA탐침 AT1이 서로 다른 3가지의 고정액에서, 그리고 배양기간의 차이와 whole cell hybridization을 사용하는 광학 현미경 또는 형광 현미경에 의한 세포밀도 측정에 있어서 hiding activity를 비교하는 방법으로 여러 다른 종의 실험에 사용되어졌고, 그의 결과를 보고하는 바이다. 형광 DNA탐침 AT1은 특이적으로, A. tamarense에 결합했지만, 형태학적으로 유사한 다른 편모충에는 결합하지 않았다. 특히 형태적으로 A. tamarense에 유사한 A. catenella는 형광 DNN탐침 AT1에 결합하지 않았다. A. tamarense은 다른 세가지 고정액을 처리하였을 때, 고정액과 상관없이 강한 형광신호를 발산하였다. 추가해서 말하면, 배양기간에 관계없이 형광 DNA탐침 AT1의 biding activity는 강했다. 광학 현미경에 의해서 측정 되어지기 보다는 형광현미경에 의해서 세포밀도가 측정되었다. 형광 DNA탐침 AT1을 이용한 A. tamarense의 동정과 계산은 이 분야에서 새로운 생물독성 감시와 예측 시스템에 기여 할 것이다.
염색질을 구성하는 histone 단백질 lysine 잔기에 histone acetylase에 의하여 결합된 acetyl기를 제거하는 histone deacetylase (HDAC)는 진핵세포 생물의 염색질 안정 파 및 유전자 발현에 매우 큰 영향을 미친다. 국내에서 분리된 영지의 HDAC 유전자를 클로닝 하고자 cDNA 및 genomic DNA를 대상으로 PCR을 수행한 결과 470bp의 cDNA유전자와, 585 bp, 589 bp 및 630 bp길이의 genomic DNA유전자 조각을 클로닝 하였다. 이들의 염기서열을 근거로 아미노산 서열을 다른 균류의 HDAC와 비교한 결과 59-72%의 상동성을 보였다.
우유 단백질인 ${\gamma}$- 카제인 유전자는 여러 호르몬들에 의해서 임신기간과 비유기기간 동안에 동물의 유선조직에서 발현되는 카제인 유전자 집단의 하나이다. 우유 단백질 유전자의 유도를 조절하는 호르몬에 관한 메커니즘 설명으로 생쥐 ${\gamma}$- 카제인 유전자가 분석되었고 특성을 밝혔다. ${\gamma}$- 카제인 유전자는 박테리오파지 EMBL 3벡터에 삽입된 제놈 도서관으로부터 ${\gamma}$- 카제인 cDNA를 probe로 사용하여 스크린하여 하나의 클론을 얻었다. ${\gamma}$- 카제인 cDNA를 probe는 부분적으로 염기배열을 밝혔으며 ATC 개시 암호와 5'-noncoding 부위를 포함하고 있다. 클론된 제놈 DNA는 제한효소 Sal I에 의해서 ENBL 3벡터로부터 분리 되었다. 3개의 DNA밴드들을 관찰할 수 있었다. 각각의 크기는 28Kb, 14Kb 그리고 9Kb 이다. 따라서 삽입된 DNA의 크기는 대략적으로 23Kb 이다. Southern blot 분석 결과, 클론된 제놈 DNA는 cDNA 5' 발단 부위를 합성한 oilgonucleotides(40 mer)와는 결합되지 않음을 보여주고, 그러나 ${\gamma}$- 카제인 cDNA와는 결합되는 것을 보여 준다. Pormoter 부위를 포함하는 ${\gamma}$- 카제인 제놈 DNA는 cDNA 5' 말단 부위의 합성된 probe에 의해서 생쥐 제놈 도서관으로 부터 스크린하여 현재 29개의 클론을 얻었다.
DNA 칩에서 사용되는 프로브를 가장 효과적으로 설계하기 위해서는 상보결합을 위한 1차구조뿐만이 아니라 열역학적인 움직임과 함께 2차구조가 고려되어야만 한다. 그러나 핵산의 기능에 큰 영향을 미치는 2차구조에 대한 연구는 일찍부터 진행되어 왔지만, 상대적으로 DNA에 대한 연구는 크게 미흡한 것이 현실이다. 이에 우리는 유전자 알고리즘을 이용한 핵산의 이차구조 예측을 통해서 보다 효과적인 프로브의 설계를 위한 방법을 고안했다.
오늘날 핵산과 단백질의 결합체에 관한 자료가 PDB(Protein Data Bank)와 같은 공공 데이터베이스에 급속도로 증가되고 있고 하나하나의 자료 자체도 많은 양의 데이터를 가지고 있기 때문에 더 이상 수작업으로 이를 분석하기란 거의 불가능할 뿐 아니라 정확도에 많은 문제가 있다. 그래서 본 연구에서는 방대한 생물학 자료를 효율적으로 분석하기 위해 자동화된 알고리즘을 개발하여 수작업에 의존하던 기존방식을 개선하였다. 이 알고리즘으로 51개의 RNA와 단백질간의 결합구조로 구성된 Dataset과 129개의 DNA와 단백질 간의 결합구조로 구성된 Dataset 분석하여 각각의 경우에 있어서의 결합성향과 결합유형을 찾아내었다. 이러한 본 연구의 결과가 아직 구조가 밝혀지지 않은 단백질-핵산간의 결합부위를 예측하는 알고리즘 개발에 기초 자료로 이용될 수 있다. 신약을 개발하는 과정에서 표적단백질의 결합부위를 예측하는데 활용될 수 있을 것이다.
유전자 발현에 매우 중요한 신호역할을 하는 프로모터 영역은 여러 전사인자들이 결합하는 특정 부위들을 갖고 있다. 전사인자의 결합부위는 프로모터의 다양한 부위에 위치하며, 진화론적으로 잘 보존된 Consensus 형태의 염기서열 패턴을 띠고 있다. 본 논문은 이러한 최적의 패턴들을 탐색하기 위해 유전자 알고리즘을 기반으로 하면서, 동시에 MEME 알고리즘의 N-occurrence-per-dataset 모델의 가정과 패턴의 길이를 결정할 수 있는 Wataru 방법의 장점을 따르는 새로운 방법을 제시하고 있다. 이러한 탐색 방법은 유전체 연구자들이 임의의 DNA 염기서열 상에서 프로모터 영역을 예측하거나 특정 전사인자의 결합부위를 탐색하는데 적극 활용할 수 있다.
Aspergillus nidulans 의 DNA 로부터 Saccharomyces cerevisiae에서 스스로 복제가능하고, 형질전환율도 삽입벡터에 비해 10\sup 4\ 배정도 높여주는 절편을 분리한 바 있다. A. nidulans에서 ANRI 의 일부를 포함한 pILJ16-4.5는 삽입벡터인 pILJ16보다 170배 정도 높은 형질전환 효율을 보였으며, S.cerevisiae와 마찬가지로 plasmid 상태로 회수가능했다. A.nidulans 페소내에서 2-3 copy 정도로 염색체와는 별개로 존재하는 것으로 나타났으며, 재형질전환능력도 있었다. ANRI은 미토콘드리아의 DNA에서 유래한 절편으로 밝고, ARS 공통절편과 유사한 절편도 11곳에 존재한다. $\Phi$X174와 SV40 DNA에서 gyrase 가 결합하는 부위의 공통편인 YRTGNYNNY도 6곳에 존재하며, ColE1에서 gyrase가 결합하는 b site와 일치하는 절편도 하나 포함하고 있으며, ABF1 결합 부위이 공통절편과 유사한 절푠$TCN_7ACG$ 도 하나 포함하고 있다. 이를 토대로 ANRI은 A.nidulans의 형질전환 후 회수가 가능한 replicating vector 개발에 이용할 수 있다.
ABF1(Autonomously replicating sequence Binding Factor 1)은 효모 genome에서 $RTCRYN_5ACG$의 염기 서열을 가지고 있는 promoter, mating-type silencer, ARS에 결합하는 DNA binding 단백질이다. E. coli 에서 ABF1 유전자를 발현하기 위하여, ABF1 유전자를 pMAL-c2 벡터에 cloning하였다.(pMAHW). pMAHW를 E. coli에 형질전환하여, ABF1 융합단백질을 발현시키고, amylose resin affinity chromatography에 의하여 분리하였다. Factor Xa protease를 이용하여 분리된 융합단백질로부터 maltose binding protein을 잘라낸 후에 gel retardation analysis 방법으로 분리된 ABF1이 ARS1에 결합하는 능력을 지니고 있음을 확인하였다. DNA 결합에 관련된 부위를 찾기 위하여, 비전형적인 zinc finger motif가 위치하는 자리에서 pMAHW의 ABF1 유전자에 His-61을 다른 아미노산으로 치환하였다. DNA binding 부위로 추정되는 ABF1 단백질의 중간지역에 Leu-353, Leu-360를 다른 아미노산으로 치환하였다. Site-specific mutagenesis 를 통해 만들어진 mutant를 gel retardation analysis와 complementation test를 통해서 비전형적인 zinc finger motif이외에 다른 DNA binding motif가 있는 것을 알 수 있었다.
cis-diamminedichloroplatinum (II)에서 아민리간드가 변화할 때, 항암성과 백금원자의 전자구조 사이의 관계를 연구하였고, 또 이러한 착물과 DNA base인 1-methylcytosine의 상호작용에 대한 메카니즘을 알기 위해서 백금(II)착물들을 분자궤도함수론적으로 연구하였다. 그 결과, 백금착물에서 중심금속의 atomic charge가 항암성에 영향을 미치고 있음을 알았다. 또한 백금착물과 1-methylcytosine의 결합은 리간드에서 금속원자로 전하이동을 하였고, 이 때 Pt(II)의 6p-orbital이 중요한 하고 있음을 발견한다. Pt-N3결합성은 $\alpha$ 와 $\pi$ 성분을 포함하고 있으며, 실험한 값과 비교할 때 비교할 때 항암성이 큰 백금착물일수록 Pt-N3 결합이 강하게 형성하고 있었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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