Lepista nuda DGUM 26501의 균사 생육을 위한 배양조건 및 세포외 분비 효소 활성을 조사하였다. 균사 생육을 위한 최적 온도는 $24^{\circ}C$였고, pH$7.0\~8.0$에서 최적 균사 생육을 나타내었다. 적정 균사생육을 위한 산소분압은 $10\%$이상이었다. 최소배지로 Czapek-Dox 한천배지에 탄소원을 변경하여 첨가시, maltose, sucrose, manitol, xylitol 등이 우수하였다. 유기산으로 gluconate가 가장 우수한 균사 생육을 보여주었다. 전반적으로 유기질소원이 무기질소원보다 균사 생육이 더 우수하였으며, 유기질소원으로 corn steep liquor(CSL), soytone, protease peptone을 사용하였을 때 균사생육이 우수하였다. 사용한 인산원 중 ammonium phosphate, 비타민원으로 pyridoxine, riboflavin, nicotinic acid 첨가시 우수한 균사 생육을 보여주었다. $24^{\circ}C$에서 10일간 배양된 L. nuda DGUM 26501의 균사외 분비효소 중 $\alpha-amylase$의 활성도가 다른 효소에 비해 상대적으로 높았으며, lipase의 활성도는 미미하게 나타났다.
본 연구는 부패 생마로부터 저온성 부패균을 분리, 동정하고 분리균의 생육특성과 다양한 효소의 부패관련성을 조사하여, 생마 저온 장기저장 및 생마 가공식품 개발을 위한 기초자료를 제시할 목적으로 수행되었다. 저온 장기저장중의 부패생마로부터 서로 다른 13종의 저온세균을 분리, 동정하였으며, 다양한 온도에서 생마 절편을 이용한 부패력 측정 결과 분리균주 중 YAM-10및 YAM-12균주가 저온부패에 직접적으로 관련됨을 확인하였으며, 이들은 각각 Pseudomonas cepacia 및 Pseudomonas rhodesiae 동정되었다. 이들 균주는 20$^{\circ}C$에서도 우수한 amylase, CMCase, xylanase 활성을 나타내었으며 , 특히 amylase 활성은 생마 부패에 중요한 역할을 하는 것으로 판단되었다. YAM-10 및 YAM-12균주는 양파절편을 부패시키지는 못하였으며, 4$\sim$12$^{\circ}C$의 온도에서도 생육가능하며, pH 5 이하 및 pH 10 이상에서는 생육이 급격히 억제되었다. 현재 생마의 저온 장기저장 및 부패억제를 위한 저온성 Pseudomonas sp.의 제어와 생마부패에 관련되는 효소들의 특성과 저해에 대한 연구 및 저장성, 관능성이 강화된 산장, 염장 등을 통한 생마 가공식품 개발이 진행 중이다.
An endo-${\beta}$-1,4-glucanase gene, cel9K, was cloned using the shot-gun method from Paenibacillus sp. X4, which was isolated from alpine soil. The gene was 2,994 bp in length, encoding a protein of 997 amino acid residues with a predicted signal peptide composed of 32 amino acid residues. Cel9K was a multimodular enzyme, and the molecular mass and theoretical pI of the mature Cel9K were 103.5 kDa and 4.81, respectively. Cel9K contains the GGxxDAGD, PHHR, GAxxGG, YxDDI, and EVxxDYN motifs found in most glycoside hydrolase family 9 (GH9) members. The protein sequence showed the highest similarity (88%) with the cellulase of Bacillus sp. BP23 in comparison with the enzymes with reported properties. The enzyme was purified by chromatography using HiTrap Q, CHT-II, and HiTrap Butyl HP. Using SDS-PAGE/activity staining, the molecular mass of Cel9K was estimated to be 93 kDa, which is a truncated form produced by the proteolytic cleavage of its C-terminus. Cel9K was optimally active at pH 5.5 and $50^{\circ}C$ and showed a half-life of 59.2 min at $50^{\circ}C$. The CMCase activity was increased to more than 150% in the presence of 2 mM $Na^+$, $K^+$, and $Ba^{2+}$, but decreased significantly to less than 50% by $Mn^{2+}$ and $Co^{2+}$. The addition of Cel9K to a commercial enzyme set (Celluclast 1.5L + Novozym 188) increased the saccharification of the pretreated reed and rice straw powders by 30.4% and 15.9%, respectively. The results suggest that Cel9K can be used to enhance the enzymatic conversion of lignocellulosic biomass to reducing sugars as an additive.
A series of experiments was carried out to determine the possibility for the non-ionic surfactant (NIS) as a feed additive for ruminant animals. The effect of the NIS on (1) the enzyme distribution in the rumen fluids of Hereford bulls, (2) the growth of pure culture of rumen bacteria and (3) rumen anaerobic fungi, (4) the ruminal fermentation characteristics of Korean native cattle (Hanwoo), and (5) the performances of Holstein dairy cows were investigated. When NIS was added to rumen fluid at the level of 0.05 and 0.1% (v/v), the total and specific activities of cell-free enzymes were significantly (p<0.01) increased, but those of cell-bound enzymes were slightly decreased, but not statistically significant. The growth rates of ruminal noncellulolytic species (Ruminobacter amylophilus, Megasphaera elsdenii, Prevotella ruminicola and Selenomonas ruminantium) were significantly (p<0.01) increased by the addition of NIS at both concentrations tested. However, the growth rate of ruminal cellulolytic bacteria (Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus albus, Ruminococcus flavefaciens and Butyrivibrio fibrisolvens) were slightly increased or not affected by the NIS. In general, NIS appears to effect Gram-negative bacteria more than Gram-positive bacteria; and non-cellulolytic bacteria more than cellulolytic bacteria. The growth rates of ruminal monocentric fungi (Neocallimastix patriciarum and Piromyces communis) and polycentric fungi (Orpinomyces joyonii and Anaeromyces mucronatus) were also significantly (p<0.01) increased by the addition of NIS at all concentrations tested. When NIS was administrated to the rumen of Hanwoo, Total VFA and ammonia-N concentrations, the microbial cell growth rate, CMCase and xylanase activities in the rumen increased with statistical difference (p<0.01), but NIS administration did not affect at the time of 0 and 9 h post-feeding. Addition of NIS to TMR resulted in increased TMR intake and increased milk production by Holstein cows and decreased body condition scores. The NEFA and corticoid concentrations in the blood were lowered by the addition of NIS. These results indicated that the addition of NIS may greatly stimulate the release of some kinds of enzymes from microbial cells, and stimulate the growth rates of a range of anaerobic ruminal microorganisms, and also stimulate the rumen fermentation characteristics and animal performances. Our data indicates potential uses of the NIS as a feed additive for ruminant animals.
천연섬유소 분해활성이 우수하고 그 효소 유도기구도 Trichoderma reesei와는 다른 Penicillium verruculosum F-3을 모균주로 사용하여 돌연변이 처리에 의한 유전적 개량을 시도함으로써 cellulase 생산성이 증진된 조절변이주를 얻고자 변이주 유도조건 변이주에 의한 cellulase 생성조건을 검토하였다. 한천평판상에서의 변이주의 선택분리 효율을 향상시키기 위하여 각종 colony 소형화제의 영향을 검토한 바 Oxgall을 배지에 1.5% 첨가하였을 때가 가장 좋았다. Cellulase 고생산성 변이주 선정의 한 지표로서 대사산물 억제의 해제를 선택했다. P. verruculosum F-3은 glucose 또는 glycerol 농도 1% 이상에서 본 효소생성이 억제되었다. 변이주 유도조건으로서 UV조사의 경우는 19분 처리로 약 0.2%, NTG 처리의 경우는 200$\mu\textrm{g}$/$m\ell$ 농도로 1시간처리로 48%의 생존율을 나타냈다. 변이처리 한 균주를 여지붕괴도, cellulose agar plate에서의 clear zone의 크기, cellulose powder 배지로 배양한 조효소액의 여지분해활 성을 조사하여 우수균주로서 UV-9, UV-10 및 NTG-3을 최종 선발했다. 각종 탄소원을 함유하는 배지에서의 cellulase 생산성을 조사한 바 KC-M-W 배지로 배양한 UV-9, UV-10 및 NTG-3의 여지분해 활성은 친주보다 각각 34%, 55%, 41% 증가되었으나, UV-9 및 NTG-3은 COA 자화능이 현저히 저하되었다. 변이주 UV-10은 COA-4 배지로 배양했을 때 친주에 비해 단백질량 30%, Avicel 분해활성 30%, 여지분해활성 20%, salicin 분해활성 50% 증가가 인정되었고, 비록 역가는 낮았지만 glucose 및 cellobiose를 함유하는 배지에서 CMC 및 salicin 분해활성을 구성적으로 생산하였다.
20왓트 백열등(白熱燈), 20왓트 형광등(螢光燈), 및 20왓트 살균등광선(殺菌燈光線)과 직사일사광선(直射日射光線)을 정제된 식용대두유(食用大豆油)에 147일간 조사(照射)하여, 각조사시료(各照射試料)의 산화속도(酸化速度)를 그 과산화가(過酸化價)측정을 통해서 조사하였다. 각광선(各光線)의 광원(光源)과 시료(試料)사이의 거리는 1m였으며, 그 조사시간(照射時間)은 직사일사광선조사시료(直射日射光線照射試料)의 조사시간(照射時間)과 일치시켰다. 일부 시료(試料)는 전실험기간을 통해서 암실(暗室)에 두어 실험대조용(實驗對照用)으로 사용하였다. 한편, 전실험기간을 통해서 매일 각광선조사시료(各光線照射試料)의 온도(溫度)를 측정하여 온도차(溫度差)에 의한 영향도 조사하였다. 각시료(各試料)의 유도기간(誘導期間)을 그 시료(試料)의 과산화가(過酸化價)가 15가 되는데 소요되는 시간으로 정하여 각조사시료(各照射試料)의 유도기간(誘導期間)을 추정(推定)하였다. 실험대조시료(實驗對照試料), 백열등(白熱燈), 형광등(螢光燈), 살균등(殺菌燈) 및 직사일사광선조사시료(直射日射光線照射試料)들의 유도기간(誘導期間)은 각각 198, 166, 119, 52 및 6일 이었다. 일사광선(日射光線)은 조사광선(照射光線)중 가장 강한 산화촉진작용(酸化促進作用)을 보여주었다. 한편 백열등광선(白熱燈光線)은 가장 약한 촉진작용(促進作用)을 보여주었으나 그 산화촉진작용(酸化促進作用)은 뚜렷하였다. 전실험기간을 통해서 각시료(各試料)간의 온도차(溫度差)는 근소하였으므로 조사광선(照射光線)의 가열효과(加熱效果)에 의한 영향은 별로 문제가 되지 않는 듯 하다.다. 6. 얻어진 최적조건에서 2일간 배양시켜 Light Gas Oil에 대한 균체수율 16.1%를 얻었으며 건조세포의 단백질함량은 48.4%였다.(個月間) 숙성(熟成)시킨 것에 비(比)하면 일반성분(一般成分) 용출량(溶出量)은 비슷하지만 식미(食味)는 약간 떨어지나 상법(常法)으로 1개월(個月) 숙성(熟成)시킨것에 비(比)하면 매우 우량한 편이었다. 4) 각처리구중(各處理區中) 일반성분(一般成分) 용출량(溶出量)과 식미(食味)를 종합(綜合)해 볼때 국법(麴法)으로서 Asp. sojae enzyme 처리구(處理區)가 속양(速釀)간장 제조법(製造法)으로서 가장 우량하였다. fraction II-b 및 fraction III라고 명명하였다. 10. 이들 4개의 fraction은 전기 영동, 초원심상 및 자외선흡수 등으로 보아서 단일의 단백질로 생각되었다. 11. Fraction I은 Avicelase활성이 강하고, fraction II-a는 cellobiase 활성이 강하였다. 그리고 fraction II는 CMCase 활성이 강하였으며, fraction III는 CMC 점도감소 활성이 강하였다. 12. 섬유소질을 각 fraction으로 가수분해한 최종산물은 cellobiose 및 glucose였다. 그리고 fraction I과 fraction II-a는 Avicel을 협동적으로 분해하였다. 13. Fraction I의 최적 pH 5.5, fraction II-a는 pH 5.0, fraction II-b는 pH 4.0, fractionIII는 pH $4.0{\sim}4.5$이며, 각 fraction의 pH 안정성은
본 연구는 홀스타인 젖소의 반추위에서 순수분리 및 동정된 섬유소 분해균인 Ruminococcus flavefaciens (H-20) 및 Fibrobactor succinogenes (H-23)의 혼합 배양액(DFM)을 수준별로 반추동물에 적용하였을 때 반추위발효와 섬유소분해효소 활성에 미치는 영향을 평가하였다. 대사시험은 반추위 fistula가 장착된 12개월령 한우 암소 4두를 이용하여 $4\times4$ Latin square 방법으로 실시되었다. 모든 처리구는 기초사료로, 농후사료 2 kg에 톨페스큐와 오차드그라스의 혼합건초 3 kg을 1일 2 회로 나누어 균등 급여하였으며, DFM을 사용하지 않은 처리구(control), 기초사료를 포함하여 1% (50 ml/day, H20 + H23), 3% (150 ml/day, H20 + H23) 및 5% (250 ml/day, H20 + H23) 수준의 네 처리군으로 나누어, 사료 급여시 DFM을 반추위 cannula 안으로 직접 주입하여 실시하였다. 본 실험 결과 급여 후 모든 시간에서, 처리구는 반추위액내 pH의 유의적 차이가 나타나지 않았으나, 반추위 암모니아 질소의 농도에서 DFM투여 후 1시간에 3% 처리구(19.47 mg/dl)는 5% 처리구(17.27 mg/dl)와 차이는 없었지만, 대조구 및 1% 처리구(14.5 및 14.9 mg/dl)와 비교하여 유의적으로 높은 농도를 보였다(p<0.05). 섬유소분해효소활력은 전체적으로 유의한 효과가 나타나지 않았으나, xylanase는 0시간에 5% 처리구($119.49\;{\mu}mol$/ml/min)가 3% 처리구($72.02\;{\mu}mol$/ml/min)와 비교하여 유의적으로 높은 농도를 보였다(p<0.05). VFA 농도는 butyric acid에서 급여후 1시간에 대조구(15.71 mM)와 비교하여 3% 처리구(24.48 mM)에서 유의적으로 높은 농도를 보였다(p<0.05). 이러한 결과로 미루어 보아 혐기성 섬유소분해 박테리아 배양액의 공급은 최소 3% 이상에서 반추위발효에 개선효과가 있는 것으로 나타났다.
오미자 에탄올 추출물의 항균활성을 조사하고, 오미자 추출물에 함유된 유기산을 분석하여 오미자 추출물 및 유기산을 첨가하여 제조한 김치의 이화학적 변화와 미생물학적 특성을 살펴본 결과는 다음과 같았다. 1.시중에 유통되는 김치에서 분리한 CS6은 김치의 숙성과 부패에 관여하는 미생물인 Lactobacillus plantarum으로 동정되었으며, 이 균주에 대해 오미자 ethanol 추출물은 항균활성을 보였다. 최소 저해농도는 62.5mg/$m\ell$이었고, 액체배지의 경우 0.5$\mu\textrm{g}$/$m\ell$ 첨가시 미생물의 증식을 완전히 저해하였다. 2. 오미자 ethanol 추출물을 첨가한 김치에서 미생물의 생육을 저해하여 산도는 증가하지 않았다. 0.5% 이하 첨가시에 색상에 영향을 미치지 않으며, 0.4% 첨가시에 맛에 영향을 주지 않았다. 3. 오미자 ethanol 추출물에 succinic acid, malic acid, tartaric acid, oxalic acid등이 포함되어 있었고, 이 중 가장 강한 항균활성을 보인 유기산은 succinic acid였으며, 이의 항균활성은 오미자 ethanol 추출물과 비슷한 저해효과를 보여주었다. 4. Succinic acid를 첨가한 김치의 경우, 미생물의 생육저해로 김치의 신선도 유지에 효과적으로 밝혀졌고, 배양말기까지 일정한 경도를 유지하였고, 역시 0.4% 이하 첨가시 맛에 큰 영향을 주지 않았다. 5. 오미자 ethanol 추출물은 $\beta$-amylase에 대해서는 낮은 저해율을 보였지만 $\alpha$-amylase, glucoamlase에 대해서 강한 저해효과를 나타내어 조직의 연화방지에 효과가 있을 것으로 생각된다. 6. 오미자 ethanol 추출물의 Avicelase 저해효과는 CMCase에 대한 저해효과보다 더 강했으며, 과숙김치에서의 경도 유지효과가 기대된다. 7. 연화와 직접적으로 관련된 효소로 생각되는 polygalacturonase에 대한 저해효과는 오미자 ethanol 추출물 25$\mu\textrm{g}$/$m\ell$ 첨가시에 66.7%의 저해율을 보였고, 30$\mu\textrm{g}$/$m\ell$ 첨가시에는 92.6%의 저해율을 보였으나, pectinesterase의 경우 15~30$\mu\textrm{g}$/$m\ell$ 첨가시에 15~20%의 낮은 저해율을 보였다.
본 연구는 한약재 부산물을 조사료 대체 사료원으로서 사용하였을 때 발효기간에 따른 in vitro 발효 특성을 조사하고자 수행되었다. 처리구는 대조구 (control), 한약재 부산물 20%와 볏짚 80% (T1), 한약재 부산물 40%와 볏짚 60% (T2), 한약재 부산물 50%와 볏짚 50% (T3), 그리고 한약재 부산물 100%와 볏짚 0% (T4)이었으며 3, 6, 9, 12, 24, 36, 48, 및 72h 동안 처리당 3반복으로 in vitro 발효실험을 실시하였다. 가스 발생량과 건물소화율은 시간이 지남에 따라, 그리고 한약재 부산물의 양이 많아짐에 따라서 증가하는 경향이었으며, 특히 72시간에 T4가 가장 높았다 (P<0.05). 메탄 발생량 또한 비슷한 결과로서 시간이 경과하고 한약재 부산물의 양이 많아짐에 따라 지속적으로 증가하였다 (P<0.05). pH는 5.39~6.80의 범위로 첨가량이 높아질 수록 유의적으로 낮아졌다 (P<0.05). 미생물 성장량은 발효 후 시간이 경과함에 따라서 점차적으로 증가하였고, 첨가구가 control 보다 높았다 (P<0.05). CMCase, Xylanase 및 amylase 효소 활력은 처리구별 특정한 패턴이나 유의적인 차이가 없었다. 본 실험의 결과는 한약재 부산물이 가스발생량, 미생물성장량 및 건물소화율을 높이고 pH를 감소시키는 등의 효과를 주어 반추위 발효의 안정화 및 향상을 꾀할 수 있고, 효소 활력을 높임으로써 사료의 이용효율을 향상시킬 수 있다는 가능성을 보여 주었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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