• 생명과학회지
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• 제33권11호
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• pp.868-875
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• 2023

Kinesin-1은 kinesin superfamily (KIF) 단백질 중에서 처음으로 확인된 모터 단백질로 세포내 미세소관 의존하여 세포내 cargo를 수송한다. Kinesin-1은 두 개의 중쇄(KHC, 또는 KIF5)와 두 개의 경쇄(KLC)로 구성된다. KIF5A의 C-말단의 93개 아미노산은 KIF5B와 KIF5C의C-말단 꼬리 영역과는 상동성이 없다. 본 연구에서 우리는 KIF5A의 C-말단 영역과 특이적으로 결합하는 단백질을 분리하기 위해 효모 2-하이브리드 스크리닝을 하였다. 본 연구에서 우리는 KIF5A와 결합하는 단백질로 유비퀴틴화 경로 및 단백질 수송에 관여하는 어댑터 단백질로 기능하는 CUE 도메인을 가진 CUEDC2를 확인하였다. CUEDC2는 KIF5A의 C-말단 영역과 결합하지만, KIF5B, KIF3A 및KLC1과는 결합하지 않았다. KIF5A는 CUEDC2의 C-말단 영역과 특이적으로 결합하였지만, CUEDC2의 다른 isoform인 CUEDC1과는 결합하지 않았다. 또한, KIF5A와 CUEDC2의 결합은 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST) 풀다운으로 단백질간 결합을 확인하였다. HEK-293T 세포에서 myc-KIF5A와 FLAG-CUEDC2을 공동 발현되었을 때, CUEDC2는 kinesin-1과 공동 면역 침전되었고, myc-KIF5A와 EGFP-CUEDC2는 세포내의 같은 위치에서 발현하였다. 이러한 결과들은 kinesin-1에 의한 세포내 화물 수송에서 CUEDC2는 KIF5A에 결합하여 kinesin-1과 화물을 연결하는 어댑터 단백질 역할을 시사한다.

• BMB Reports
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• 제42권12호
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• pp.840-845
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• 2009

Mitogen- and stress-activated protein kinase (MSK1) palys a crucial role in the regulation of transcription downstream of extracellular-signal-regulated kinase1/2 (ERK1/2) and mitogen-activated protein kinase p38. MSK1 can be phosphorylated and activated in cells by both ERK1/2 and p38$\alpha$. In this study, Casein Kinase 2 (CK2) was identified as a binding and regulatory partner for MSK1. Using the yeast two-hybrid system, MSK1 was found to interact with the CK2$\beta$ regulatory subunit of CK2. Interactions between MSK1 and the CK2$\alpha$ catalytic subunit and CK2$\beta$ subunit were demonstrated in vitro and in vivo. We further found that CK2$\alpha$ can only interact with the C-terminal kinase domain of MSK1. Using site-directed mutagenesis assay and mass spectrometry, we identified five sites in the MSK1 C-terminus that could be phosphorylated by CK2 in vitro: Ser757, Ser758, Ser759, Ser760 and Thr793. Of these, Ser757, Ser759, Ser760 and Thr793 were previously unknown.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제17권1호
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• pp.58-66
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• 2007

Isolation, expression, and characterization of a novel $endo-{\beta}-1,3(4)-D-glucanase$ with high specific activity and homology to Bacillus lichenases is described. One clone was screened from a genomic library of Paenibacillus sp. F-40, using lichenan-containing plates. The nucleotide sequence of the clone contains an ORF consisting of 717 nucleotides, encoding a ${\beta}-glucanase$ protein of 238 amino acids and 26 residues of a putative signal peptide at its N-terminus. The amino acid sequence showed the highest similarity of 87% to other ${\beta}-1,3-1,4-glucanases$ of Bacillus. The gene fragment Bg1 containing the mature glucanase protein was expressed in Pichia pastoris at high expression level in a 3-1 high-cell-density fermenter. The purified recombinant enzyme Bg1 showed activity against barley ${\beta}-glucan$, lichenan, and laminarin. The gene encodes an $endo-{\beta}-1,3(4)-D-glucanase$ (E. C. 3.2.1.6). When lichenan was used as substrate, the optimal pH was 6.5, and the optimal temperature was $60^{\circ}C$. The $K_m,\;V_{max},\;and\;k_{cat}$ values for lichenan are 2.96mg/ml, $6,951{\mu}mol/min{\cdot}mg,\;and\;3,131s^{-1}$, respectively. For barley ${\beta}-glucan$ the values are 3.73mg/ml, $8,939{\mu}mol/min{\cdot}mg,\;and\;4,026s^{-1}$, respectively. The recombinant Bg1 had resistance to pepsin and trypsin. Other features of recombinant Bg1 including temperature and pH stability, and sensitivity to some metal ions and chemical reagents were also characterized.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제40권2호
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• pp.163-167
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• 2012

D-Xylose는 Saccharomyces cerevisiae에서 기질로 이용될 수 없어 S. cerevisiae가 이용 가능한 D-xylulose로의 전환이 요구된다. 효소고정화 시스템을 통한 D-xylose로부터 D-xylulose로의 전환을 위해 대장균의 D-xylose 이성화효소(XI)의 카르복시 말단에 양이온 교환수지를 이용한 단순 정제 및 고정화가 가능하도록 10-arginine tag(R10)을 융합하였다. 융합단백질인 XIR10은 재조합 대장균에서 과잉발현되었고 단일 단계의 양이온 교환 크로마토그라피를 통하여 고순도로 정제되었다. 정제된 XIR10은 카르복시 말단의 10-arginine tag과의 정전기적 상호작용을 통하여 양이온 교환수지에 고정화되었다. 고정화 및 비고정화된 XIR10은 넓은 범위의 pH 및 온도에서 비슷한 D-xylose 이성화효소 활성을 보였다. 이 결과는 양이온 교환수지로의 고정화는 XIR10의 효소적 기능에 영향을 주지 않는다는 것을 나타낸다. 고정화된 XIR10의 최적화된 조건에서 D-xylose의 25%는 D-xylulose로 이성화되었다. 본 연구의 결과들은 10-arginine tag과 양이온 교환수지간의 상호작용을 통해 정전기적 고정화된 XIR10이 D-xylose로부터 D-xylulose로의 전환에 응용 가능하다는 것을 명확하게 보여주었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제45권2호
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• pp.155-161
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• 2017

Paenibacillus woosongensis의 유전체 부분 염기서열로부터 유추된 xylanase 유전자를 PCR 증폭하여 클로닝하고 염기서열을 결정하였다. 클로닝된 xylanase 유전자는 xyn11B로 명명되었으며, 356 아미노산으로 구성된 단백질을 코드하는 1,071 뉴클레오티드로 이루어졌다. Xyn11B의 아미노산 배열을 분석한 결과 glycosyl hydrolase family 11에 속하는 xylanase와 상동성이 높은 활성영역과 탄수화물 결합영역을 포함하고 있는 다영역 효소로 확인되었다. SignalP4.1 server로부터 아미노 말단의 26개 잔기가 signal peptide로 예측되었다. DEAE-Sepharose와 Phenyl-Separose 컬럼 크로마토그래피 과정을 통해 xyn11B 유전자를 함유한 재조합 대장균의 균체 파쇄상등액으로부터 Xyn11B를 부분 정제하였다. 부분 정제된 Xyn11B의 반응특성을 조사한 결과 pH 6.5와 $50^{\circ}C$에서 최대 반응활성을 보였고 birchwood xylan이나 oat spelt xylan보다 arabinoxylan에 대한 활성이 높았으며 셀룰로스, 만난과 para-nitrophenyl-${\beta}$-xylopyranoside에 대해서는 분해활성이 없었다. Xyn11B의 활성은 $Ca^{2+}$과 $Mg^{2+}$에 의해서는 약간 증가한 반면에 $Cu^{2+}$, $Ni^{2+}$, $Fe^{3+}$, $Mn^{2+}$에 의해서는 크게 저해되었고 SDS에 의해서 완전히 저해되었다.

• Bulletin of the Korean Chemical Society
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• 제32권8호
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• pp.2577-2583
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• 2011

We have designed a 20-residue hybrid peptide CA(1-8)-MA(1-12) (CAMA) incorporating residues 1-8 of cecropin A (CA) and residues 1-12 of magainin 2 (MA) with high bacterial cell selectivity. CAMA-P2 is an ${\alpha}$-helical antimicrobial peptide designed from a CAMA hybrid peptide and substitution of Gly-Ile-Gly hinge sequence of CAMA to Pro influences the flexibility at central part of CAMA. Based on structure-activity relationships of CAMA peptides, to investigate the effects of the total positive charges on antimicrobial activity of CAMA-P2, the $Ser^{14}{\rightarrow}$Lys analogue (CAMA-syn1) was synthesized. The role of tryptophan at C-terminal ${\alpha}$-helix on its antimicrobial activity as well as synergistic activity was also investigated using $Ser^{14}{\rightarrow}$Lys/$Phe^{18}{\rightarrow}$Trp analogue (CAMA-syn2). Also, we designed CAMA-syn3 by substitution of $Lys^{16}$ located opposite side of substituted $Lys^{14}$ of CAMA-syn1 with Leu residue, resulting in increase of hydrophobicity and amphipathicity of the peptide. All of CAMA-syn analogues showed good antimicrobial activities similar to those of CAMA and CAMA-P2. The CAMA-syn1 and CAMA-syn2 showed low hemolytic activity and cytotoxicity against human keratinocyte Haca-T cells while CAMA-syn3 showed hemolytic activity and cytotoxicity at its MIC value. We then investigated their abilities to act synergistically in combination with the antimicrobial flavonoids and synthetic compounds screened in our laboratory. The results showed that all peptides exhibited synergistic effects with dihydrobinetin, while only CAMA-syn2 exhibited synergistic effects with YKAs3001 against both S. aureus and MRSA, suggesting that Trp residue at C-terminus of CAMA-syn2 may facilitate the polar antibiotic flavonoids and synthetic compounds to permeabilize the membrane. This study will be useful for the development of new antibiotic peptides with potent antimicrobial and synergistic activity but without cytotoxicity.

• Restorative Dentistry and Endodontics
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• 제19권2호
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• pp.585-601
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• 1994

The purpose of this study was to evaluate the ability of several intracoronal base materials to prevent cervical leakage of a bleaching agent into the dentinal tubules and along the root canal. In this study, thirty-two anterior teeth were used. After lingual access was prepared in each tooth, tooth was instrumented with a step-back technique to a Nos. 40-50 using K-type files. All teeth were obturated with a lateral condensation technique. Excess gutta percha was removed with a warm instrument to the facial level of the CEJ. Teeth were divided into four groups : Teeth in control group were not filled with base material. Teeth in groups 1, 2, and 3 had 2mm of gutta percha removed with a warm instrument, then Dycal, Fuki II LC and Z-100 were filled with palstic instruments on the top of the gutta percha respectively. All teeth were bleached for 7 days, fresh bleach was added for another 7 days, then a 10 % methylene blue dye was placed inside the access preparation. They were stored at $37^{\circ}C$ and $100^{\circ}C$ humidity for 5 days. Each tooth was sectioned perpendicular to the long axis using a diamond disk. Initial cuts were made at the most coronal level of facial and lingual CEJ's, then another cuts continued appically in the levels of 0.5mm, 1.5mm, and 2.0mm respectively. The amount of dye leakage through the dentinal tubules was determined at each cut section. In addition, when the cut specimen was determined to be last penetration of any dye, this level was recorded as depth of apical leakage from the coronal terminus of the gutta percha, Dycal, Fuji II LC and Z-100. The acquired data were analyzed by Tukey's Multiple Range Test adn Cochran-Mantel-Haenszel Test to see if there was any statistically significant difference in dye penetration and linear apical leakage among the groups. The results were as follows : 1. Control group at levels of CEJ and 0.5mm, group 3 at level of 1.5mm, and group 2 AND 3 at level of 2.0mm showed the least dye penetration through the facial or lingual dentinal tubules, but there were no significant difference among three groups. 2. Group 2 at levels of CEJ and 0.5mm, group 3 at level of 1.5mm, and group 2 and 3 at level of 2.0mm showed the least dye penetration through the proximal dentinal tubules, but there were no significant difference among control group, group 2, and group 3. 3. Group 1 showed the greatest dye penetration through the facial or lingual and proximal dentinal tubules at all levels, and there were significant difference with other three groups. 4. Control group and group 1 showed 2mm apical dye leakage at facial or lingual and proximal aspects, group 2 showed 1.5mm, and group 3 showed 0.5mm.

• 생명과학회지
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• 제25권6호
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• pp.631-637
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• 2015

Streptmyces avidinii에서 발현되는 Streptavidin은 vitamin H인 d-biotin 4분자에 결합하며 해리상수(Kd)가 10⁻¹⁵ M를 나타내는 아주 강한 비공유결합이다. 이러한 streptavidin과 biotin 상호간의 강한 결합력은 수많은 생물체 분자들의 탐지 및 특징을 연구하는데 응용되어져 왔으므로 Escherichia coli에서 수용성 streptavidin의 기능적 발현에 대한 연구는 매우 유용하다. 즉 Escherichia coli에서 streptavidin을 발현시키기 위해 streptavidin유전자를 T7 RNA polymerase/T7 promoter를 이용하는 pET-22b 플라스미드로 클로닝하였다. 또한 N-말단에 pelB leader를 포함하여 발현된 streptavidin의 periplasmic space로 운반하여 수용성 단백질형태의 분비를 촉진하였으며 C-말단에는 6개의 polyhistidine tags를 두어 정제하는데 사용되었다. 정제된 streptavidin단백질은 10-20 mg/ml 의 높은 회수율을 나타내었으며 SDS-PAGE에서 가열하는 경우 변성되어 17 kD인 monomer형태를, 가열하지 않는 경우에는 68 kDa으로 원래의 tetramer형태를 나타내었다. 따라서 streptavidin의 tetramer 구조는 비공유결합에 의해 이루어짐을 알 수 있었다. Size-exclusion chromatography에 의한 streptavidin의 구조 역시 tetramer를 재확인할 수 있었다. 정제된 수용성 streptavidin은 Westernblot실험에서 biotinylation된 단백질을 탐지하였으며 이 결과는 정제된 streptavidin이 biotin에 결합하는 기능이 존재함을 나타내었다. 이상의 모든 결과를 종합해보면 본 연구에서 구축된 발현시스템을 통하여 발현된 streptavidin은 높은 회수율을 나타내어 대량생산이 가능하였으며 자연상태의 streptavidin과 동일한 homotetramer를 형성하고 biotin에 결합할 수 있는 기능을 나타내었다.

• 생명과학회지
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• 제26권10호
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• pp.1113-1120
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• 2016

우리나라의 전통 발효 된장으로부터 균체외 효소로 mannanase를 생산하는 세균 2주가 분리되었다. 분리균 WL-6과 WL-11은 형태적 특성, 생화학적 성질 및 16S rDNA의 염기서열에 따라 Bacillus subtilis로 확인되었다. 이들 두 균주로부터 각각 mannanase 유전자를 대장균에 클로닝하여 염기서열을 결정한 결과 mannanase 유전자는 362 아미노산으로 구성된 단백질을 코드하며 1,086 뉴클레오티드로 동일하게 이루어졌다. WL-6과 WL-11 mannanase (Man6, Man11)의 아미노산 잔기 배열은 서로 8개 잔기가 다르며 GH family 26에 속하는 B. subtilis의 mannanases와 매우 상동성이 높았다. Man6과 Man11의 아미노 말단의 26개 아미노 잔기가 signal peptide로 예측되었다. 재조합 대장균로부터 각각 생산된 Man6과 Man11은 94~95% 정도가 균체내에 존재하였고, mannotriose, mannotetraose, mannopentaose, mannohexaose와 같은 만노올리고당과 locust bean gum을 유사하게 분해하여 주된 반응산물로 mannobiose와 mannotriose를 생성하였다. Man6는 55℃와 pH 6.0, Man11은 60℃와 pH 5.5에서 각각 최대 반응활성을 보였으며, Man11이 Man6에 비해 열안정성이 높았다.

• Molecules and Cells
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• 제20권3호
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• pp.305-314
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• 2005

Investigation of chemically synthesized inositol 1,4,5-trisphosphate [$Ins(1,4,5)P_3$] analogs has led to the isolation of a novel binding protein with a molecular size of 130 kDa, characterized as a molecule with similar domain organization to phospholipase C-${\delta}1$ (PLC-${\delta}1$) but lacking the enzymatic activity. An isoform of the molecule was subsequently identified, and these molecules have been named PRIP (PLC-related, but catalytically inactive protein), with the two isoforms named PRIP-1 and -2. Regarding its ability to bind $Ins(1,4,5)P_3$ via the pleckstrin homology domain, the involvement of PRIP-1 in $Ins(1,4,5)P_3$-mediated $Ca^{2+}$ signaling was examined using COS-1 cells overexpressing PRIP-1 and cultured neurons prepared from PRIP-1 knock-out mice. Yeast two hybrid screening of a brain cDNA library using a unique N-terminus as bait identified GABARAP ($GABA_A$ receptor associated protein) and PP1 (protein phosphatase 1), which led us to examine the possible involvement of PRIP in $GABA_A$ receptor signaling. For this purpose PRIP knock-out mice were analyzed for $GABA_A$ receptor function in relation to the action of benzodiazepines from the electrophysiological and behavioral aspects. During the course of these experiments we found that PRIP also binds to the b-subunit of $GABA_A$ receptors and PP2A (protein phosphtase 2A). Here, we summarize how PRIP is involved in $Ins(1,4,5)P_3$-mediated $Ca^{2+}$ signaling and $GABA_A$ receptor signaling based on the characteristics of binding molecules.