산업적으로 lysine 발효 산업에 이용되고 있는 B. lactofermentum으로부터 lysine 생합성에 관여하는 tetrahyrodipicolinate N-succinyl transferase를 지령하는 dapD 유전자를 E. coli의 dapD 결손변이주와의 complementation test를 통하여 cloning하였다. 재조합 plamid는 3.6 kb의 DNA 단편을 함유하고 있었으며 Southern blot hybridization을 통하여 dapD 유전자는 B. lactofermentum으로부터 유래하였으며 염색체 DNA내에 single copy로 존재함을 알 수 있었다. 또한 lysine 생성량 분석을 통하여 E. coli에서 B. lactofermentum dapD 유전자의 발현을 확인하였다.
B. lactofermentum의 lysine 생합성에 있어서 DDH경로 및 ddh gene이 지닌 중요성을 조사하기 위하여, site-specific mutagenesis technique를 통하여 B. lactofermentum의 ddh gene을 disruption함으로서 DDH 경로를 차단시켰다. B. lactofermentum ddh mutant는 wild type 및 AEC내성 균주보다 성장이 매우 저조하였으며 lysine 생산량에서도 급격한 저하를 가져왔다. 이와 같이 B. lactofermentum이 DAP 경로만을 가졌을 때 세포의 성장 및 lysine 생산량에 있어서 극적인 저하를 가져왔기 때문에 B. lactofermentum에서의 DDH 경로는 meso-DAP 및 lysine 생합성에 있어 필수적인 경로로 작용한다는 것을 확인하였다. 그러므로 C. glutamicum과 B. lactofermentum과 같은 corynebacteria가 lysine을 많이 생산하는 것은 DDH 경로가 부가적으로 존재하기 때문이며, 이러한 DDH 경로는 metabolic flux가 증가되면 중간 대사물을 lysine으로 변화시키는 중요한 경로로 작용할 것이라 사료된다.
For frequency improvement of protoplast fusion in Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum lactofermentum and Corynebacterium glutamicum, the effect of plasma expanders on fusion and cell wall regeneration, compatison between direct and two-step selection method, tendency of fusion frequency according to pH of fusion fluid and polyethylene glycol concentration were examined. By addition of 3% polyvinyl pyrrolidone to cell wall regeneration medium, regeneration frequencies were expressed 23 (Brevibacterium lactofermentum), 10.4 (Brevibacterium flavum) and 2.7 (Corynebacterium glutamicum) times higher than those of none polyvinyl pyrrolidone medium respectively.
원형질체 융합에 사용할 genetic selection marker로써 자외선 조사와 NTG 처리에 의해 Brevibacteriurn lactofermeηturn S SWA(arg trp)와 B. lactofermenturn SWB(met ser)를 분리하였다. 이 균주릎 배양하여 증식기에 penicillin G를 처리한 후, 0.4 M sucrose를 첨가한 lysis fluid에서 lysozyme을 $400\mu\textrm{g}$/ml의 농도로 16시간 처리 하였을 때, B. lactofermenturn SWA는 99.98%, B. lactofermentum SWB는 99.93%의 원형질체 형성률을 나타내었다. 윈형질체 융합에서는 100 mM $CaCl_{2}$, 30%의 PEG 6,000과 fusion fluid릎 15분간 처리하였을때, B. lactofermentum SWA와 B. lactofermentum SWB의 융합빈도는 $2.30\times 10^{-5}$로 나타내었다. 원형질체 융합에 의해 언어진 융합균주의 유전적 분석을 위해 selective media와 non-selective media에서 생장한 colony를 계산함으로써 각 marker간의 재조합주의 형성빈도를 조사하였으며, 이들을 분석하여 유전자간의 순서를 결정하였다.
To investigate impediments to plasmid transformation in Brevibacterium flavum BF4 and B. lactofermentum BL1, cell surface barriers were determined by measuring growth inhibition whilst enzymatic barriers were determined by comparing DNA methylation properties. B. lactofermentum was more sensitive to growth inhibition by glycine than B. flavum. Release of cellular proteins during sonication was more rapid for B. lactofermentum than for B. flavum. Plasmid DNA (pCSL 17) isolated from B. flavum transformed recipient $McrBC^+$ strains of Escherichia coli with lower efficiency than $McrBC^-$. McrBC digestion of this DNA confirmed that B. flavum contain methylated cytidines in the target sequence of McrBc sequences but B. lactofermentum contained a different methylation pattern. DNA derived from the B. lactofermentum transformed recipient $EcoKR^+$ strains of E. coli with lower efficiency than $EcoKR^-$, indicating the presence of methylated adenosines in the target sequence of EcoK sequences. The present data describe the differences in the physical and enzymatic barriers between two species of corynebacteria and also provide some insight into the successful foreign gene expression in corynebacteria.
An endogenous cryptic plasmid, pBL1, which has been used to construct plasmid vectors for coryneform bacteria producing amino acids, was eliminated from Brevibacterium lactofermentum. The pBL1 was partially digested with Sau3AI and the resulting DNA fragments were subcloned into a suicide vector pEM1 which contains a kanamycin-resistant (km$^{r}$) gene. KM$^{r}$ B. lactofermentum transconjugants were obtained by conjugal transfer of the pEM1 derivatives containing pBL1 DNA fragments from Escherichia coli into B. lactofermentum. A km$^{r}$ transconjugant was analyzed to contain a plasmid pEB14, which occurred in vivo by homologous recombination between pBL1 and the conjugal-transferred plasmid. The pEB14 including the pEM1-derived km$^{r}$ gene was found to be lost concomitantly with km$^{r}$ phenotype, resulting in the construction of a pBL1-free strain of B lactofermentum. Based on transformation efficiencies and plasmid stability, the resultant pBL1- free strain is more useful than wild strain as a host cell for genetic manipulation. It could be concluded that foreign plasmid DNAs are efficiently isolated and analyzed from the pBL1-free strain because of the absence of endogenous pBL1 plasmid.
본 연구는 B. lactofermentum에서 ddh유전자의 증폭이 lysine 생성량에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 먼저 E. coli-B. lactofermentum shuttle vector pEB1 및 pEB2를 제조하였으며, 제조된 shuttle vector에 ddh 유전자를 ligation하여 재조합 plasmid pRK1 및 pRK2를 구축하였다. B. lactofermentum에서 ddh 유전자를 증폭시키기 위하여 재조합 plasmld를 B. lactofermentum으로 도입하여 DDH 활성을 측정한 결과 대조균보다 7배 정도 증가하였다. 또한 lysine 생성량의 비교 분석에서는 재조합 plasmid를 함유한 균주의 경우 48시간 이후부터 control 균주보다 lysine 생성량이 증가하기 시작하여 72시간 때에는 최대치를 나타내었으며 그 이후는 오히려 감소하였다. 최대치를 나타낸 72시간 때의 lysine 생성량은 대조균주가 4.30∼4.38 g/l를 나타내었으며 pRK1 및 pRK2를 함유한 균주는 각각 5.34 g/l 및 5.07 g/l이었다. 이상의 결과로 미루어 볼 때 ddh유전자의 증폭에 의한 B. lactofermentum의 lysine 생성량은 대조균주에 비하여 18∼20% 정도 증가하였다.
A Brevibacterium lactofermentum gene coding for a glucose-specific permease of the phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase system (PTS) was cloned, by complementing an Escherichia coli mutation affecting a ptsG gene with the B. lactofermentum genomic library, and completely sequenced. The gene was identified as a ptsG, which enables an E. coli transformant to transport non-metabolizable glucose analogue 2-deoxyglucose (2DG). The ptsG gene of B. lactofermentum consists of an open reading frame of 2,025 nucleotides encoding a polypeptide of 674 amino acid residues and a TAA stop codon. The 3' flanking region contains two stem-loop structures which may be involved in transcriptional termination. The deduced amino acid sequence of the B. lactofermentum enzyme $II^{GIe}$ specific to glucose ($EII^{GIe}$) has a high homology with the Corynebacterium glutamicum enzyme $II^{Man}$ specific to glucose and mannose ($EII^{Man}$), and the Brevibacterium ammoniagenes enzyme $II^{GIc}$ specific to glucose ($EII^{GIc}$). The 171-amino-acid C-terminal sequence of the $EII^{Glc}$ is also similar to the Escherichia coli enzyme $IIA^{GIc}$ specific to glucose ($IIA^{GIc}$). It is interesting that the arrangement of the structural domains, IIBCA, of the B. lactofermentum $EII^{GIc}$ protein is identical to that of EIIs specific to sucrose or $\beta$-glucoside. Several in vivo complementation studies indicated that the B. lactofermentum $EII^{Glc}$ protein could replace both $EII^{ Glc}$ and $EIIA^{Glc}$ in an E. coli ptsG mutant or crr mutant, respectively.
Kim, Ok-Mi;Kim, Hyun-Jeong;Kim, Dal-Sang;Park, Dong-Chul;Lee, Kap-Rang
Journal of Microbiology and Biotechnology
/
제5권5호
/
pp.250-256
/
1995
The ddh gene encoding meso-diaminopimelate (meso-DAP)-dehydrogenase (DDH) in Brevibacterium lactofermentum was isolated by complementation of the Escherichia coli dapD mutation. It was supposed from subcloning experiments and complementation tests that the evidence for DDH activity appeared in about 2.5 kb Xhol fragmented genome. The 2.5 kb Xhol fragment containing the ddh gene was sequenced, and an open reading frame of 960 bp encoding a polypeptide comprising 320 amino acids was found. Computer analysis indicated that the deduced amino acid of the B. lactofermentum ddh gene showed a high homology with that of the Corynebacterium glutamicum ddh gene.
$_L-Lysine$ 발효산업에 이용되고 있는 B. lactofermentum의 L-lysine 생합성은 succinylase 경로와 dehydrogenase 경로를 통하여 일어난다. 특히 lysine 생산 균주에 부가적으로 존재하는 dehydrogenase 경로는 lysine 생합성에 있어서 필수적인 경로로 작용하며 이때 meso-DAP-dehydrogenase (DDH)를 암호화하는 ddh gene이 관여한다. 그러므로 B. lactofermentum의 lysine 발효에 있어서 ddh gene의 over expression에 의한 lysine 생성량을 비교 조사하기 위하여, shuttle vector pEB1 및 pJC1으로 ddh gene을 삽입하여 재조합 plasmid pRK1 및 pRK31을 구축하였고 이를 B. lactofermentum으로 도입시켜 DDH 활성을 측정한 결과 pRK1을 함유한 균주는 대조균주보다 7배 정도, pRK31을 함유한 균주는 14배 정도 증가하였다. 또한 Shuttle vector를 함유한 대조균주와 재조합 plasmid를 함유한 균주간의 성장 비교에서는 서로 비슷한 수준을 나타내었으며 플라스크 배양에서 lysine 생성량의 비교 분석에서는 재조합 plasmid를 함유한 균주의 경우 48시간 이후부터 대조균주보다 lysine 생성량이 증가하기 시작하여 72시간때에는 최대치를 나타내었으며 그 이후는 오히려 감소하였다. 최대치를 나타낸 72시간 때의 lysine 생성량은 대조균주가 4.38g/L를 나타내었으며 pRK1 및 pRK31을 함유한 균주는 각각 5.34g/L 및 5.21 g/L이었다. 이상의 결과로 미루어 볼 때 B. lactofermentum내에서 ddh gene의 증폭에 의한 lysine 생성량은 pRK1 및 pRK31에서 대조균주보다 각각 20% 및 19% 증가하였다. 또한 발효조 배양에서의 lysine 생성량도 재조합 균주가 대조균주보다 23% 정도 증가를 나타내어 B. lactofermentum에서 ddh gene의 증폭으로 lysine 생성량이 증가하였음을 확인하였다.
본 웹사이트에 게시된 이메일 주소가 전자우편 수집 프로그램이나
그 밖의 기술적 장치를 이용하여 무단으로 수집되는 것을 거부하며,
이를 위반시 정보통신망법에 의해 형사 처벌됨을 유념하시기 바랍니다.
[게시일 2004년 10월 1일]
이용약관
제 1 장 총칙
제 1 조 (목적)
이 이용약관은 KoreaScience 홈페이지(이하 “당 사이트”)에서 제공하는 인터넷 서비스(이하 '서비스')의 가입조건 및 이용에 관한 제반 사항과 기타 필요한 사항을 구체적으로 규정함을 목적으로 합니다.
제 2 조 (용어의 정의)
① "이용자"라 함은 당 사이트에 접속하여 이 약관에 따라 당 사이트가 제공하는 서비스를 받는 회원 및 비회원을
말합니다.
② "회원"이라 함은 서비스를 이용하기 위하여 당 사이트에 개인정보를 제공하여 아이디(ID)와 비밀번호를 부여
받은 자를 말합니다.
③ "회원 아이디(ID)"라 함은 회원의 식별 및 서비스 이용을 위하여 자신이 선정한 문자 및 숫자의 조합을
말합니다.
④ "비밀번호(패스워드)"라 함은 회원이 자신의 비밀보호를 위하여 선정한 문자 및 숫자의 조합을 말합니다.
제 3 조 (이용약관의 효력 및 변경)
① 이 약관은 당 사이트에 게시하거나 기타의 방법으로 회원에게 공지함으로써 효력이 발생합니다.
② 당 사이트는 이 약관을 개정할 경우에 적용일자 및 개정사유를 명시하여 현행 약관과 함께 당 사이트의
초기화면에 그 적용일자 7일 이전부터 적용일자 전일까지 공지합니다. 다만, 회원에게 불리하게 약관내용을
변경하는 경우에는 최소한 30일 이상의 사전 유예기간을 두고 공지합니다. 이 경우 당 사이트는 개정 전
내용과 개정 후 내용을 명확하게 비교하여 이용자가 알기 쉽도록 표시합니다.
제 4 조(약관 외 준칙)
① 이 약관은 당 사이트가 제공하는 서비스에 관한 이용안내와 함께 적용됩니다.
② 이 약관에 명시되지 아니한 사항은 관계법령의 규정이 적용됩니다.
제 2 장 이용계약의 체결
제 5 조 (이용계약의 성립 등)
① 이용계약은 이용고객이 당 사이트가 정한 약관에 「동의합니다」를 선택하고, 당 사이트가 정한
온라인신청양식을 작성하여 서비스 이용을 신청한 후, 당 사이트가 이를 승낙함으로써 성립합니다.
② 제1항의 승낙은 당 사이트가 제공하는 과학기술정보검색, 맞춤정보, 서지정보 등 다른 서비스의 이용승낙을
포함합니다.
제 6 조 (회원가입)
서비스를 이용하고자 하는 고객은 당 사이트에서 정한 회원가입양식에 개인정보를 기재하여 가입을 하여야 합니다.
제 7 조 (개인정보의 보호 및 사용)
당 사이트는 관계법령이 정하는 바에 따라 회원 등록정보를 포함한 회원의 개인정보를 보호하기 위해 노력합니다. 회원 개인정보의 보호 및 사용에 대해서는 관련법령 및 당 사이트의 개인정보 보호정책이 적용됩니다.
제 8 조 (이용 신청의 승낙과 제한)
① 당 사이트는 제6조의 규정에 의한 이용신청고객에 대하여 서비스 이용을 승낙합니다.
② 당 사이트는 아래사항에 해당하는 경우에 대해서 승낙하지 아니 합니다.
- 이용계약 신청서의 내용을 허위로 기재한 경우
- 기타 규정한 제반사항을 위반하며 신청하는 경우
제 9 조 (회원 ID 부여 및 변경 등)
① 당 사이트는 이용고객에 대하여 약관에 정하는 바에 따라 자신이 선정한 회원 ID를 부여합니다.
② 회원 ID는 원칙적으로 변경이 불가하며 부득이한 사유로 인하여 변경 하고자 하는 경우에는 해당 ID를
해지하고 재가입해야 합니다.
③ 기타 회원 개인정보 관리 및 변경 등에 관한 사항은 서비스별 안내에 정하는 바에 의합니다.
제 3 장 계약 당사자의 의무
제 10 조 (KISTI의 의무)
① 당 사이트는 이용고객이 희망한 서비스 제공 개시일에 특별한 사정이 없는 한 서비스를 이용할 수 있도록
하여야 합니다.
② 당 사이트는 개인정보 보호를 위해 보안시스템을 구축하며 개인정보 보호정책을 공시하고 준수합니다.
③ 당 사이트는 회원으로부터 제기되는 의견이나 불만이 정당하다고 객관적으로 인정될 경우에는 적절한 절차를
거쳐 즉시 처리하여야 합니다. 다만, 즉시 처리가 곤란한 경우는 회원에게 그 사유와 처리일정을 통보하여야
합니다.
제 11 조 (회원의 의무)
① 이용자는 회원가입 신청 또는 회원정보 변경 시 실명으로 모든 사항을 사실에 근거하여 작성하여야 하며,
허위 또는 타인의 정보를 등록할 경우 일체의 권리를 주장할 수 없습니다.
② 당 사이트가 관계법령 및 개인정보 보호정책에 의거하여 그 책임을 지는 경우를 제외하고 회원에게 부여된
ID의 비밀번호 관리소홀, 부정사용에 의하여 발생하는 모든 결과에 대한 책임은 회원에게 있습니다.
③ 회원은 당 사이트 및 제 3자의 지적 재산권을 침해해서는 안 됩니다.
제 4 장 서비스의 이용
제 12 조 (서비스 이용 시간)
① 서비스 이용은 당 사이트의 업무상 또는 기술상 특별한 지장이 없는 한 연중무휴, 1일 24시간 운영을
원칙으로 합니다. 단, 당 사이트는 시스템 정기점검, 증설 및 교체를 위해 당 사이트가 정한 날이나 시간에
서비스를 일시 중단할 수 있으며, 예정되어 있는 작업으로 인한 서비스 일시중단은 당 사이트 홈페이지를
통해 사전에 공지합니다.
② 당 사이트는 서비스를 특정범위로 분할하여 각 범위별로 이용가능시간을 별도로 지정할 수 있습니다. 다만
이 경우 그 내용을 공지합니다.
제 13 조 (홈페이지 저작권)
① NDSL에서 제공하는 모든 저작물의 저작권은 원저작자에게 있으며, KISTI는 복제/배포/전송권을 확보하고
있습니다.
② NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 상업적 및 기타 영리목적으로 복제/배포/전송할 경우 사전에 KISTI의 허락을
받아야 합니다.
③ NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 보도, 비평, 교육, 연구 등을 위하여 정당한 범위 안에서 공정한 관행에
합치되게 인용할 수 있습니다.
④ NDSL에서 제공하는 콘텐츠를 무단 복제, 전송, 배포 기타 저작권법에 위반되는 방법으로 이용할 경우
저작권법 제136조에 따라 5년 이하의 징역 또는 5천만 원 이하의 벌금에 처해질 수 있습니다.
제 14 조 (유료서비스)
① 당 사이트 및 협력기관이 정한 유료서비스(원문복사 등)는 별도로 정해진 바에 따르며, 변경사항은 시행 전에
당 사이트 홈페이지를 통하여 회원에게 공지합니다.
② 유료서비스를 이용하려는 회원은 정해진 요금체계에 따라 요금을 납부해야 합니다.
제 5 장 계약 해지 및 이용 제한
제 15 조 (계약 해지)
회원이 이용계약을 해지하고자 하는 때에는 [가입해지] 메뉴를 이용해 직접 해지해야 합니다.
제 16 조 (서비스 이용제한)
① 당 사이트는 회원이 서비스 이용내용에 있어서 본 약관 제 11조 내용을 위반하거나, 다음 각 호에 해당하는
경우 서비스 이용을 제한할 수 있습니다.
- 2년 이상 서비스를 이용한 적이 없는 경우
- 기타 정상적인 서비스 운영에 방해가 될 경우
② 상기 이용제한 규정에 따라 서비스를 이용하는 회원에게 서비스 이용에 대하여 별도 공지 없이 서비스 이용의
일시정지, 이용계약 해지 할 수 있습니다.
제 17 조 (전자우편주소 수집 금지)
회원은 전자우편주소 추출기 등을 이용하여 전자우편주소를 수집 또는 제3자에게 제공할 수 없습니다.
제 6 장 손해배상 및 기타사항
제 18 조 (손해배상)
당 사이트는 무료로 제공되는 서비스와 관련하여 회원에게 어떠한 손해가 발생하더라도 당 사이트가 고의 또는 과실로 인한 손해발생을 제외하고는 이에 대하여 책임을 부담하지 아니합니다.
제 19 조 (관할 법원)
서비스 이용으로 발생한 분쟁에 대해 소송이 제기되는 경우 민사 소송법상의 관할 법원에 제기합니다.
[부 칙]
1. (시행일) 이 약관은 2016년 9월 5일부터 적용되며, 종전 약관은 본 약관으로 대체되며, 개정된 약관의 적용일 이전 가입자도 개정된 약관의 적용을 받습니다.