• 한국식품영양과학회지
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• 제30권5호
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• pp.802-805
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• 2001

산업적으로 lysine 발효 산업에 이용되고 있는 B. lactofermentum으로부터 lysine 생합성에 관여하는 tetrahyrodipicolinate N-succinyl transferase를 지령하는 dapD 유전자를 E. coli의 dapD 결손변이주와의 complementation test를 통하여 cloning하였다. 재조합 plamid는 3.6 kb의 DNA 단편을 함유하고 있었으며 Southern blot hybridization을 통하여 dapD 유전자는 B. lactofermentum으로부터 유래하였으며 염색체 DNA내에 single copy로 존재함을 알 수 있었다. 또한 lysine 생성량 분석을 통하여 E. coli에서 B. lactofermentum dapD 유전자의 발현을 확인하였다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제26권5호
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• pp.387-392
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• 1998

B. lactofermentum의 lysine 생합성에 있어서 DDH경로 및 ddh gene이 지닌 중요성을 조사하기 위하여, site-specific mutagenesis technique를 통하여 B. lactofermentum의 ddh gene을 disruption함으로서 DDH 경로를 차단시켰다. B. lactofermentum ddh mutant는 wild type 및 AEC내성 균주보다 성장이 매우 저조하였으며 lysine 생산량에서도 급격한 저하를 가져왔다. 이와 같이 B. lactofermentum이 DAP 경로만을 가졌을 때 세포의 성장 및 lysine 생산량에 있어서 극적인 저하를 가져왔기 때문에 B. lactofermentum에서의 DDH 경로는 meso-DAP 및 lysine 생합성에 있어 필수적인 경로로 작용한다는 것을 확인하였다. 그러므로 C. glutamicum과 B. lactofermentum과 같은 corynebacteria가 lysine을 많이 생산하는 것은 DDH 경로가 부가적으로 존재하기 때문이며, 이러한 DDH 경로는 metabolic flux가 증가되면 중간 대사물을 lysine으로 변화시키는 중요한 경로로 작용할 것이라 사료된다.

• 미생물학회지
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• 제23권3호
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• pp.190-196
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• 1985

For frequency improvement of protoplast fusion in Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum lactofermentum and Corynebacterium glutamicum, the effect of plasma expanders on fusion and cell wall regeneration, compatison between direct and two-step selection method, tendency of fusion frequency according to pH of fusion fluid and polyethylene glycol concentration were examined. By addition of 3% polyvinyl pyrrolidone to cell wall regeneration medium, regeneration frequencies were expressed 23 (Brevibacterium lactofermentum), 10.4 (Brevibacterium flavum) and 2.7 (Corynebacterium glutamicum) times higher than those of none polyvinyl pyrrolidone medium respectively.

• 미생물학회지
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• 제28권2호
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• pp.98-103
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• 1990

원형질체 융합에 사용할 genetic selection marker로써 자외선 조사와 NTG 처리에 의해 Brevibacteriurn lactofermeηturn S SWA(arg trp)와 B. lactofermenturn SWB(met ser)를 분리하였다. 이 균주릎 배양하여 증식기에 penicillin G를 처리한 후, 0.4 M sucrose를 첨가한 lysis fluid에서 lysozyme을 $400\mu\textrm{g}$/ml의 농도로 16시간 처리 하였을 때, B. lactofermenturn SWA는 99.98%, B. lactofermentum SWB는 99.93%의 원형질체 형성률을 나타내었다. 윈형질체 융합에서는 100 mM $CaCl_{2}$, 30%의 PEG 6,000과 fusion fluid릎 15분간 처리하였을때, B. lactofermentum SWA와 B. lactofermentum SWB의 융합빈도는 $2.30\times 10^{-5}$로 나타내었다. 원형질체 융합에 의해 언어진 융합균주의 유전적 분석을 위해 selective media와 non-selective media에서 생장한 colony를 계산함으로써 각 marker간의 재조합주의 형성빈도를 조사하였으며, 이들을 분석하여 유전자간의 순서를 결정하였다.

• Biotechnology and Bioprocess Engineering:BBE
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• 제10권3호
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• pp.225-229
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• 2005

To investigate impediments to plasmid transformation in Brevibacterium flavum BF4 and B. lactofermentum BL1, cell surface barriers were determined by measuring growth inhibition whilst enzymatic barriers were determined by comparing DNA methylation properties. B. lactofermentum was more sensitive to growth inhibition by glycine than B. flavum. Release of cellular proteins during sonication was more rapid for B. lactofermentum than for B. flavum. Plasmid DNA (pCSL 17) isolated from B. flavum transformed recipient $McrBC^+$ strains of Escherichia coli with lower efficiency than $McrBC^-$. McrBC digestion of this DNA confirmed that B. flavum contain methylated cytidines in the target sequence of McrBc sequences but B. lactofermentum contained a different methylation pattern. DNA derived from the B. lactofermentum transformed recipient $EcoKR^+$ strains of E. coli with lower efficiency than $EcoKR^-$, indicating the presence of methylated adenosines in the target sequence of EcoK sequences. The present data describe the differences in the physical and enzymatic barriers between two species of corynebacteria and also provide some insight into the successful foreign gene expression in corynebacteria.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제23권2호
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• pp.164-169
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• 1995

An endogenous cryptic plasmid, pBL1, which has been used to construct plasmid vectors for coryneform bacteria producing amino acids, was eliminated from Brevibacterium lactofermentum. The pBL1 was partially digested with Sau3AI and the resulting DNA fragments were subcloned into a suicide vector pEM1 which contains a kanamycin-resistant (km$^{r}$) gene. KM$^{r}$ B. lactofermentum transconjugants were obtained by conjugal transfer of the pEM1 derivatives containing pBL1 DNA fragments from Escherichia coli into B. lactofermentum. A km$^{r}$ transconjugant was analyzed to contain a plasmid pEB14, which occurred in vivo by homologous recombination between pBL1 and the conjugal-transferred plasmid. The pEB14 including the pEM1-derived km$^{r}$ gene was found to be lost concomitantly with km$^{r}$ phenotype, resulting in the construction of a pBL1-free strain of B lactofermentum. Based on transformation efficiencies and plasmid stability, the resultant pBL1- free strain is more useful than wild strain as a host cell for genetic manipulation. It could be concluded that foreign plasmid DNAs are efficiently isolated and analyzed from the pBL1-free strain because of the absence of endogenous pBL1 plasmid.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제26권5호
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• pp.400-405
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• 1998

본 연구는 B. lactofermentum에서 ddh유전자의 증폭이 lysine 생성량에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 먼저 E. coli-B. lactofermentum shuttle vector pEB1 및 pEB2를 제조하였으며, 제조된 shuttle vector에 ddh 유전자를 ligation하여 재조합 plasmid pRK1 및 pRK2를 구축하였다. B. lactofermentum에서 ddh 유전자를 증폭시키기 위하여 재조합 plasmld를 B. lactofermentum으로 도입하여 DDH 활성을 측정한 결과 대조균보다 7배 정도 증가하였다. 또한 lysine 생성량의 비교 분석에서는 재조합 plasmid를 함유한 균주의 경우 48시간 이후부터 control 균주보다 lysine 생성량이 증가하기 시작하여 72시간 때에는 최대치를 나타내었으며 그 이후는 오히려 감소하였다. 최대치를 나타낸 72시간 때의 lysine 생성량은 대조균주가 4.30∼4.38 g/l를 나타내었으며 pRK1 및 pRK2를 함유한 균주는 각각 5.34 g/l 및 5.07 g/l이었다. 이상의 결과로 미루어 볼 때 ddh유전자의 증폭에 의한 B. lactofermentum의 lysine 생성량은 대조균주에 비하여 18∼20% 정도 증가하였다.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제9권5호
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• pp.582-588
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• 1999

A Brevibacterium lactofermentum gene coding for a glucose-specific permease of the phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase system (PTS) was cloned, by complementing an Escherichia coli mutation affecting a ptsG gene with the B. lactofermentum genomic library, and completely sequenced. The gene was identified as a ptsG, which enables an E. coli transformant to transport non-metabolizable glucose analogue 2-deoxyglucose (2DG). The ptsG gene of B. lactofermentum consists of an open reading frame of 2,025 nucleotides encoding a polypeptide of 674 amino acid residues and a TAA stop codon. The 3' flanking region contains two stem-loop structures which may be involved in transcriptional termination. The deduced amino acid sequence of the B. lactofermentum enzyme $II^{GIe}$ specific to glucose ($EII^{GIe}$) has a high homology with the Corynebacterium glutamicum enzyme $II^{Man}$ specific to glucose and mannose ($EII^{Man}$), and the Brevibacterium ammoniagenes enzyme $II^{GIc}$ specific to glucose ($EII^{GIc}$). The 171-amino-acid C-terminal sequence of the $EII^{Glc}$ is also similar to the Escherichia coli enzyme $IIA^{GIc}$ specific to glucose ($IIA^{GIc}$). It is interesting that the arrangement of the structural domains, IIBCA, of the B. lactofermentum $EII^{GIc}$ protein is identical to that of EIIs specific to sucrose or $\beta$-glucoside. Several in vivo complementation studies indicated that the B. lactofermentum $EII^{Glc}$ protein could replace both $EII^{ Glc}$ and $EIIA^{Glc}$ in an E. coli ptsG mutant or crr mutant, respectively.

• Journal of Microbiology and Biotechnology
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• 제5권5호
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• pp.250-256
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• 1995

The ddh gene encoding meso-diaminopimelate (meso-DAP)-dehydrogenase (DDH) in Brevibacterium lactofermentum was isolated by complementation of the Escherichia coli dapD mutation. It was supposed from subcloning experiments and complementation tests that the evidence for DDH activity appeared in about 2.5 kb Xhol fragmented genome. The 2.5 kb Xhol fragment containing the ddh gene was sequenced, and an open reading frame of 960 bp encoding a polypeptide comprising 320 amino acids was found. Computer analysis indicated that the deduced amino acid of the B. lactofermentum ddh gene showed a high homology with that of the Corynebacterium glutamicum ddh gene.

• 한국식품과학회지
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• 제31권1호
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• pp.224-230
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• 1999

$_L-Lysine$ 발효산업에 이용되고 있는 B. lactofermentum의 L-lysine 생합성은 succinylase 경로와 dehydrogenase 경로를 통하여 일어난다. 특히 lysine 생산 균주에 부가적으로 존재하는 dehydrogenase 경로는 lysine 생합성에 있어서 필수적인 경로로 작용하며 이때 meso-DAP-dehydrogenase (DDH)를 암호화하는 ddh gene이 관여한다. 그러므로 B. lactofermentum의 lysine 발효에 있어서 ddh gene의 over expression에 의한 lysine 생성량을 비교 조사하기 위하여, shuttle vector pEB1 및 pJC1으로 ddh gene을 삽입하여 재조합 plasmid pRK1 및 pRK31을 구축하였고 이를 B. lactofermentum으로 도입시켜 DDH 활성을 측정한 결과 pRK1을 함유한 균주는 대조균주보다 7배 정도, pRK31을 함유한 균주는 14배 정도 증가하였다. 또한 Shuttle vector를 함유한 대조균주와 재조합 plasmid를 함유한 균주간의 성장 비교에서는 서로 비슷한 수준을 나타내었으며 플라스크 배양에서 lysine 생성량의 비교 분석에서는 재조합 plasmid를 함유한 균주의 경우 48시간 이후부터 대조균주보다 lysine 생성량이 증가하기 시작하여 72시간때에는 최대치를 나타내었으며 그 이후는 오히려 감소하였다. 최대치를 나타낸 72시간 때의 lysine 생성량은 대조균주가 4.38g/L를 나타내었으며 pRK1 및 pRK31을 함유한 균주는 각각 5.34g/L 및 5.21 g/L이었다. 이상의 결과로 미루어 볼 때 B. lactofermentum내에서 ddh gene의 증폭에 의한 lysine 생성량은 pRK1 및 pRK31에서 대조균주보다 각각 20% 및 19% 증가하였다. 또한 발효조 배양에서의 lysine 생성량도 재조합 균주가 대조균주보다 23% 정도 증가를 나타내어 B. lactofermentum에서 ddh gene의 증폭으로 lysine 생성량이 증가하였음을 확인하였다.