Genetic Recombination of Brevibacterium lactofermentum by Protoplast Fusion

Brevibacterium lactofermentum의 원형질체 융합에 의한 유전자 재조합

Brevibacterium lactofermentum SWA (arg trp) and B. lactofermentum SWB (met ser) were obtained from UV and NTG treatment. The rates of protoplast formation by B. lactofermentum SWA and SWB were 99.93% and 99.98%, respectively when each strain was treated with penicillin G in mid exponential growth phase, followed by incubation with 400 $\mu\textrm{g}$/ml of lysozyme in lysis fluid supplemented with 0.4M sucrose. Frequencies of protoplast regeneration in B. lactofermentum SWA and B. lactofermentum SWB were 9.27% and 10.32% respectively, on regeneration medium containing 0.5M sodium succinate, 50 mM $Mg^{2+}$, and 3% PVP. In intraspecific protoplast fusion between B. lactofermentum SWA and B. lactofermentum SWB, fusion frequency of $2.30\times 10^{-5}$ was observed by using the 100mM $CaCl_{2}$ and 30% PEG 6,000 in fusion fluid. Relative recombinant frequencies in each marker by means of selective media could be used for genetic analysis.

원형질체 융합에 사용할 genetic selection marker로써 자외선 조사와 NTG 처리에 의해 Brevibacteriurn lactofermeηturn S SWA(arg trp)와 B. lactofermenturn SWB(met ser)를 분리하였다. 이 균주릎 배양하여 증식기에 penicillin G를 처리한 후, 0.4 M sucrose를 첨가한 lysis fluid에서 lysozyme을 $400\mu\textrm{g}$/ml의 농도로 16시간 처리 하였을 때, B. lactofermenturn SWA는 99.98%, B. lactofermentum SWB는 99.93%의 원형질체 형성률을 나타내었다. 윈형질체 융합에서는 100 mM $CaCl_{2}$, 30%의 PEG 6,000과 fusion fluid릎 15분간 처리하였을때, B. lactofermentum SWA와 B. lactofermentum SWB의 융합빈도는 $2.30\times 10^{-5}$로 나타내었다. 원형질체 융합에 의해 언어진 융합균주의 유전적 분석을 위해 selective media와 non-selective media에서 생장한 colony를 계산함으로써 각 marker간의 재조합주의 형성빈도를 조사하였으며, 이들을 분석하여 유전자간의 순서를 결정하였다.