대두의 발효를 통하여 생리활성을 가지고 있는 이소플라본 aglycone 함량을 높이기 위한 ${\beta}$-glucosidase와 대두에 다량 함유되어 있는 stachyose, rafinose와 같은 난소화성 oligosaccharides를 분해하기 위해 ${\alpha}$-galactosidase 효소 분비 미생물을 김치로부터 ${\alpha}$-galactosidase와 ${\beta}$-glucosidase를 생산하는 미생물을 탐색하였다. 탐색과정을 위해서 선별한 미생물을 16S rDNA sequencing 동정한 결과, Weissella cibaria 동정되어 Weissella cibaria K-M1-4로 명명하였다. Weissella cibaria K-Ml-4를 대두 액체배지에서 18시간동안 배양한 후, 생산한 효소는 배양액을 에탄을 침전, DEAE sepharose, sephacryl S-100HR column chromatography 통하여 ${\alpha}$-galactosidase의 경우, 정제도 5.3배, 수율 3.5% 그리고 ${\beta}$-glucosidase의 경우, 정제도 4.4배, 수율 2.9%로 정제되었다. ${\alpha}$-Galactosidase 효소특성은 $60^{\circ}C$에서 최대 활성을 나타내었으며, $80^{\circ}C$에서 30분 처리시 43% 잔존활성을 보였다. pH 8.0에서 최대 활성을 나타내었으며, pH 5.0-9.0에서 안정하였다. 금속이온에 대한 영향에서 $Fe^{2+}$과 $Cu^{2+}$을 첨가하였을 때 효소 활성이 증가하였다. p-Nitrophenyl-${\alpha}$-D-galacto-pyranoside (PNPG) 기질에 대한 Km은 0.98 mM이었고, Vmax는 $1.81{\mu}$mole/min 이었다. ${\beta}$-Glucosidase 효소 특성은 $50^{\circ}C$에서 최대 활성을 나타내었으며, $80^{\circ}C$에서 30분 처리시 46% 잔존활성을 보였다. pH 7.0에서 최대 활성을 나타내었으며, pH 5.0-9.0에서 안정하였다. 금속이온에 대한 영향에서 $Fe^{2+},\;Co^{2+},\;Cu^{2+}$을 첨가하였을 때 효소 활성이 증가하였다. p-Nitrophenyl-${\beta}$-D-gluco-pyranoside (PNPG)에 대한 Km값은 1.24mM이었고, Vmax는 $6.81{\mu}$mole/min 이었다.
N-$\varepsilon$-aminocaproyl-$\alpha$-D-galactopyranosylamine-sepharose를 담체로 하는 affinity chromatography에 의한 해바라기씨 유래 $\alpha$-galactosidase($\alpha$-D-galactoside galactohydrolase EC 3. 2. 1. 22)의 정제방법과 정제효소에 대한 효소화학적 성질을 규명하였다. N-$\varepsilon$-aminocaproyl-$\alpha$-D-galactopyranosylamine의 흡착제를 합성하여 sepharose에 coupling하였다. 기질 p-nitrophenyl $\alpha$-D-galactopyranoside에 대한 정제효소의 비활성은 291.66 units/mg였고, 조효소와 비교하여 115배의 정제 배율을 나타내었다. 정제효소의 순도는 SDS-polyacryl amide gel전기 영동법 에 의해 단일 band를 나타내었으며, 분자량은 42,000으로 추정되었다. 정제효소의 최적 pH와 온도는 4.5, 55$^{\circ}C$이며, pH 4-5, 30-55$^{\circ}C$의 범위에서 pH와 온도 안정성을 나타내었다. 또한 정제효소는 Ag$^{2+}$, Hg$^{2+}$, CO$^{2+}$의 금속에 의해 70%이상의 저해효과를 나타내었다. 정제효소는 melibiose, raffinose 및 copra galactomannan에 대한 galactose의 유리를 TLC에 의해 확인하였고, 각 기질에 대한 galactose의 가수분해 속도를 HPLC에 의해 비교하였다.
배경: 최근 조직판막의 구조적 손상에 있어서 동물면역 반응이 중요한 역할을 할 가능성이 제기되면서 동물의 대표적 이종항원 물질인 알파-갈 항원결정인자에 대한 환자의 면역반응에 관한 관심이 높아지고 있다. 또한 알파-갈은 세포 표면에 존재하며 이는 녹색콩 알파-갈락토시다아제 라는 효소를 이용하여 제거할 수 있다고 알려져 있고 조직 표면의 알파-갈 항원결정인자는 Griffonia Simplicifolia의 동종렉틴 중 B4타입에 선택적으로 결합하여 이를 이용해서 염색할 수 있다고 알려져 있다. 이에 본 연구팀은 조직판막을 만드는데 많이 사용되는 돼지의 대동맥 판막 및 심낭 조직을 가지고 녹색콩알파-갈락토시다아제를 이용하여 이들 조직의 알파-갈 항원결정인자를 제거할 수 있는지 알아 보고자하였다. 대상 및 방법: 신선한 돼지의 대동맥 판막 및 심낭 조직을 0.5 unit/mL, 1.0 unit/mL, 2.0 unit/mL 농도의 녹색콩 알파-갈락토시다아제로 pH 6.5, $4^{\circ}C$에서 24시간 처리한 뒤 이를 Griffonia Simplicifolia 동종렉틴 B4 타입을 이용한 면역조직형광염색으로 염색하여, 각각의 농도에서 효소 반응 후 해당 조직의 알파-갈 항원결정인자가 얼마나 제거되는지를 형광염색의 정도로 판단하였다. 결과: 돼지의 대동맥 판막 조직의 경우 1.0 unit/mL농도의 녹색콩 알파-갈락토시다아제를 pH 6.5, $4^{\circ}C$ 에서 24시간 처리하였을 때 형광염색이 거의 되지 않을 정도로 알파-갈 항원결정인자가 제거되었고 이는 효소의 농도를 2.0 unit/mL로 증가시켰을 때에도 비슷한 양상을 보였다. 돼지의 심낭 조직의 경우 효소 처리 전의 알파-갈 염색에서도 대동맥 판막조직에 비하여 많은 양의 형광염색을 보였으며 효소 처리의 농도도 대동맥 판막의 경우보다 높은 2.0 unit/mL의 농도에서 알파-갈 항원결정인자가 제거되는 양상을 보였다. 걸론: 돼지의 대동맥 판막 조직과 심낭 조직의 알파-갈 항원결정인자는 eriffonia simplicifolia의 동종렉틴 B4를 사용한 면역조직형광염색에서 잘 염색되었으며 이를 알파-갈락토시다아제를 사용하여 제거하였을 때 각각 1.0 unit/mL, 2.0 unit/mL 농도의 녹색콩 알파-갈락토시다아제를 $4^{\circ}C$, pH 6.5의 조건에서 24시간 반응시켰을 때 효과적으로 상당량 제거할 수 있었다. 향후 돼지의 판막조직 및 심낭조직으로 만드는 조직판막의 내구성 증대에 대표적인 동물 면역항원인 알파-갈 항원결정인자의 제거가 유용한 도구가 될 수 있을 것이며 앞으로 알파-갈락토시다아제로 처리한 돼지의 조직판막에 대한 인간혈장의 항-갈 항체 및 항-갈 단클론항체를 이용한 직접적인 면역학적 연구가 필요하다.
Simila, Janika;Gernig, Anita;Murray, Patrick;Fernandes, Sara;Tuohy, Maria G.
Journal of Microbiology and Biotechnology
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제20권12호
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pp.1653-1663
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2010
The first gene (${\alpha}$-gal1) encoding an extracellular ${\alpha}$-Dgalactosidase from the thermophilic fungus Talaromyces emersonii was cloned and characterized. The ${\alpha}$-gal1 gene consisted of an open reading frame of 1,792 base pairs interrupted by six introns that encoded a mature protein of 452 amino acids, including a 24 amino acid secretory signal sequence. The translated protein had highest identity with other fungal ${\alpha}$-galactosidases belonging to glycosyl hydrolase family 27. The ${\alpha}$-gal1 gene was overexpressed as a secretory protein with an N-terminal histidine tag in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Recombinant ${\alpha}$-Gal1 was secreted into the culture medium as a monomeric glycoprotein with a maximal yield of 10.75 mg/l and purified to homogeneity using Hisbinding nickel-agarose affinity chromatography. The purified enzyme was maximally active at $70^{\circ}C$, pH 4.5, and lost no activity over 10 days at $50^{\circ}C$. ${\alpha}$-Gal1 followed Michaelis-Menten kinetics ($V_{max}\;of\;240.3{\mu}M/min/mg,\;K_m\;of\;0.294 mM$) and was inhibited competitively by galactose ($K_m{^{obs}}$ of 0.57 mM, $K_i$ of 2.77 mM). The recombinant T. emersonii ${\alpha}$-galactosidase displayed broad substrate preference, being active on both oligo- and polymeric substrates, yet had strict specificity for the ${\alpha}$-galactosidic linkage. Owing to its substrate preference and noteworthy stability, ${\alpha}$-Gal1 is of particular interest for possible biotechnological applications involving the processing of plant materials.
An Antarctic bacterial isolate displaying extracellular ${\alpha}$-galactosidic activity was named Paenibacillus sp. LX-20 based on 16S rRNA gene sequence analysis. Optimal activity for the LX-20 ${\alpha}$-galactosidase occurred at pH 6.0-6.5 and $45^{\circ}C$. The enzyme immobilized on the smart polymer Eudragit L-100 retained 70% of its original activity after incubation for 30 min at $50^{\circ}C$, while the free enzyme retained 58% of activity. The enzyme had relatively high specificity for ${\alpha}$-D-galactosides such as p-nitrophenyl-${\alpha}$-galactopyranoside, melibiose, raffinose and stachyose, and was resistant to some proteases such as trypsin, pancreatin and pronase. Enzyme activity was almost completely inhibited by $Ag^+$, $Hg^{2+}$, $Cu^{2+}$, and sodium dodecyl sulfate, but activity was not affected by ${\beta}$-mercaptoethanol or EDTA. LX-20 ${\alpha}$-galactosidase may be potentially useful as an additive for soybean processing in the feed industry.
본 저해물질은 10Mug의 Alpha-D-glucosidase에 대해서 50Mug 및 100Mug을 첨가했을 때 저해율은 각각 60, 80 정도였으며 enzyme-inhibitor complex를 비교적 서서히 형성하여 5분간 진처리하였을 때 약 55의 저해율을 나타내었다. 그리고 Alpha-D-glucosidase, Alpha-galactosidase및 Beta-galactosidase를 제외한 탄수화물 분해효소에 대해서는 저해능이 없었으며, Alpha-D-glucosidase에 대한 저해양상은 non-competitive type 이었으며 Ki 값은 118 $\mu$g/m$\ell$였다.
The ${\alpha}$-galactosidase-coding gene agaAJB13 was cloned from Sphingomonas sp. JB13 showing 16S rDNA (1,343 bp) identities of ${\leq}97.2%$ with other identified Sphingomonas strains. agaAJB13 (2,217 bp; 64.9% GC content) encodes a 738-residue polypeptide (AgaAJB13) with a calculated mass of 82.3 kDa. AgaAJB13 showed the highest identity of 61.4% with the putative glycosyl hydrolase family 36 ${\alpha}$-galactosidase from Granulicella mallensis MP5ACTX8 (EFI56085). AgaAJB13 also showed <37% identities with reported protease-resistant or Sphingomonas ${\alpha}$-galactosidases. A sequence analysis revealed different catalytic motifs between reported Sphingomonas ${\alpha}$-galactosidases (KXD and RXXXD) and AgaAJB13 (KWD and SDXXDXXXR). Recombinant AgaAJB13 (rAgaAJB13) was expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). The purified rAgaAJB13 was characterized using p-nitrophenyl-${\alpha}$-D-galactopyranoside as the substrate and showed an apparent optimum at pH 5.0 and $60^{\circ}C$ and strong resistance to trypsin and proteinase K digestion. Compared with reported proteaseresistant ${\alpha}$-galactosidases showing thermolability at $50^{\circ}C$ or $60^{\circ}C$ and specific activities of <71 U/mg with or without protease treatments, rAgaAJB13 exhibited a better thermal stability (half-life of >60 min at $60^{\circ}C$) and higher specific activities (225.0-256.5 U/mg). These sequence and enzymatic properties suggest AgaAJB13 is the first identified and characterized Sphingomonas ${\alpha}$-galactosidase, and shows novel protease resistance with a potential value for basic research and industrial applications.
Park, Jae-Yong;Jeong, Seon-Ju;Lee, Ae-Ran;Park, Ji-Yeong;Jeong, Woo-Ju;Kim, Jeong-Hwan
Journal of Microbiology and Biotechnology
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제17권12호
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pp.2081-2084
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2007
A 2.5 kb aga gene encoding ${\alpha}$-galactosidase (${\alpha}$-Gal) from Leuconostoc mesenteroides SY1 was cloned into pSJE, an E. coli-Leuconostoc shuttle vector. The recombinant plasmid, pSJEaga, was introduced into Leuconostoc citreum KCTC3526 (ATCC49370) by electroporation. Transcription level of aga was the highest in cells grown on raffinose (1%, w/v) followed by cells grown on galactose, melibiose, fructose, glucose, and sucrose. Western blot using antibodies against ${\alpha}$-Gal showed similar results to slot-blot results and enzyme activity measurements. All the results indicated that the aga was successfully expressed in L. citreum and its transcription was under the carbon catabolite repression (CCR).
인체의 대장은 여러 종류의 균들에 의하여 상재균총이 이루어져 있는데 이들중 혐기성 균들이 주종을 이루고 있다. 이들 혐기성 균들 중 가장 많은 수가 Bacteroides이다. 본 연구에서 한국인으로부터 분리된 Bacteroides fragilis Roid 8은 장내의 다른 혐기성 균주들에 비하여 $N-acetyl-{\beta}-glucosaminidase$, ${\alpha}-fucosidase$, ${\beta}glucuronidase$ chitobiase, PNPCase 등의 활성이 높았다. ${\beta}-galactosidase$, ${\beta}-xylosidase$, ${\alpha}-arabinofuranosidae$활성은 없었고 ${\alpha}-glucosidase$, ${\beta}-glucosidase$, ${\alpha}-galactosidae$ 등의 생산은 Bifidobacteria 에 비하여 낮았다. BHI 기본배지에 여러 종류의 탄수화물을 첨가하여 배양한 뒤 생산된 $N-acetyl-{\beta}-glucosaminidae$, ${\alpha}-fucosidase$, ${\beta}-glucuronidase$ chitobiase, PNPCase, ${\beta}-glucosidase$, ${\beta}-glucosidase$${\alpha}-galactosidase$ 활성을 조사한 결과 모두 glucose와 lactose 첨가배지에서 이들 효소들의 활성이 낮았다. 조사된 모든 효소들에 대하여 특이적으로 현저히 생산을 증가시키는 당은 없었다. 이들 8개의 효소에 대하여 최적 pH와 최적온도가 조사되었다.
저자들은 출생 후 정상적인 발달을 보이다가 생후 6개월부터 의식과 운동 발달의 퇴행을 보이던 13개월 환아에서 효소 검사를 시행하여 ${\beta}$-galactosidase의 결핍을 확인하고 $GM_1$-gangliosidosis type 1으로 진단하였지만, 후에 추가적으로 시행한 효소 검사에서 ${\alpha}$-neuraminidase의 결핍도 발견되어 galactosialidosis로 진단한 증례를 경험하였기에 문헌 고찰과 함께 보고하고자 한다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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