• Plant Biotechnology Reports
• /
• 제1권1호
• /
• pp.19-25
• /
• 2007

To develop an efficient screening method for detection of the transgene in Chinese cabbage (Brassica rapa spp. pekinensis) utilizing Basta spray, optimal conditions for Basta application were examined in this study. Two transgenic Chinese cabbage lines were obtained through Agrobacterium-mediated transformation and used as transgenic positive controls in the Basta screening experiment. Differential concentrations of glufosinate-ammonium were sprayed into three different growth stages of 12 commercial Chinese cabbage cultivars. The results showed that no plants could survive higher than 0.05% glufosinate-ammonium, and plants at the 2-3 leaf stage were most vulnerable to glufosinate-ammonium. On the other hand, no damage was observed in the transgenic control plants. Reliability of the Basta spray method was proven by showing perfect co-segregation of the tolerance to glufosinate-ammonium and the presence of the bar gene in T₁ segregating populations of the transgenic lines, as revealed by both PCR and Southern blot analyses. Using the developed Basta screening method, we tried to investigate the transgene flow through pollen dispersal, but failed to detect any transgene-containing non-transgenic Chinese cabbages whose parents had been planted adjacent to transgenic Chinese cabbages in field conditions. However, the transgene was successfully detected using Basta spray from the non-transgenic plants bearing the transgene introduced by hand-pollination. Since the Basta spray method developed in this study is easy to apply and economical, it will be a valuable tool for understanding the mechanism of gene flow through pollen transfer and for establishing a biosafety test protocol for genetically modified (GM) Chinese cabbage cultivars.

• Journal of Plant Biotechnology
• /
• 제35권4호
• /
• pp.299-306
• /
• 2008

선발마커로 두 종류의 항생제 (hpt와 nptII)와 제초제(bar) 유전자를 사용하여 아그로박테리움을 이용한 수정된 들깨 형질전환방법을 개발하였다. 들깨 배축 절편을 pMOG6-Bar 운반체 혹은 pCK-Bar 운반체를 가진 아그로박테리움 EHA 105와 각각 3일간 공동배양 하였다. 1차로 형성된 신초는 하이그로마이신(15mg/L)이나 카나마이신(125 mg/L)을 사용하여 선발하였고 재분화 된 신초들은 확실한 형질전환체를 얻기 위해서 포스피노트리신(1.2 mg/L)에서 한번 더 선발하였다. 뿌리는 호르몬이 없는 MS배지에서 재분화 신초로 부터 유도하였으며 80개의 재분화개체를 획득하였다. 들깨 지놈으로 형질전환유전자의 삽입은 서던 블럿으로 확인하였고 유전자의 발현은 노던 블럿으로 분석하였다. To 식물체로부터 유도된 T1들깨 종자들은 후대로의 안정된 유전자 전이를 확인하기 위하여 0.3% 바스타 제초제 살포로 확인하였다.

• 한국초지조사료학회지
• /
• 제26권1호
• /
• pp.1-8
• /
• 2006

조사료로서 소화율을 향상시킨 신품종 형질 전환 오차드그래스를 개발할 목적으로 lignin 합성경로에 있어서 중요한 효소 유전자 중의 하나인 COMT 유전자를 cloning하여 그 특성을 해명하였다. 오차드그래스의 COMT 유전자는 식물체의 전 조직에서 발현되고 있었으며, 특히 줄기와 뿌리조직에서 높은 발현량을 나타냄으로서 목질화에 크게 관여하는 lignin 생합성 유전자일 것으로 판단되었다. Dgcomt 유전자의 발현을 억제시킨 형질전환 오차드그래스를 개발하기 위하여 Dgcomt 유전자를 RNAi 발현벡터에 도입한 후, Agrobacterium 형질전환시스템을 이용하여 오차드그래스에 도입하였다. PCR, Southern 및 Northern 분석 결과 RNAi 발현벡터가 genome에 도입되었으며, Dgcomt 유전자의 발현이 상당한 수준으로 저하되었음을 확인하였다. Dgcomt 유전자의 발현억제는 식물체의 목질화와 더불어 증가되는 lignin의 축적량을 감소시킬 것으로 기대되며 향후 소화율이 증가된 고품질 신품종 목초의 개발에 유용하게 활용될 것으로 판단된다.

• 한국식품과학회지
• /
• 제36권3호
• /
• pp.369-374
• /
• 2004

유전자재조합 콩 Roundup Ready는 Agrobacterium sp. CP4에서 유래한 유전자를 함유하고 있으며 이 삽입 유전자에서 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase(CP4EPSPS)가 발현된다. 본 연구실에서는 이 단백질을 유전자재조합 콩과 시중에서 구입한 두부 시료에서 CP4EPSPS 특이 단클론 및 다클론 항체를 이용하여 immunoblotting법으로 검사하였다. 분리 정제된 CP4EPSPS 재조합 단백질은 단클론 또는 다클론 항체를 이용할 때 각각 $0.006{\mu}g$ 또는 $0.0006{\mu}g$의 검증 한계치로 확인할 수 있었다. 유전자재조합 콩에 발현된 CP4EPSPS 검증 한계치는 단클론 또는 다클론 항체를 이용할 때 각각 $0.001{\mu}g$과 $0.0001{\mu}g$이었다. 다클론 항체를 이용하여 조사된 9종의 두부에서는 2종에서 양성결과를 확인하였다. 본 연구에서 생산된 단클론 및 다클론 항체를 이용하여 확립된 immunoblotting법은 콩 가공식품 중의 glyphosate 내성 유전자재조합 콩 검사에 적용될 수 있을 것이다.

• Applied Biological Chemistry
• /
• 제39권1호
• /
• pp.25-31
• /
• 1996

식물체내 칼모듈린과 칼모듈린 메틸화의 기능에 대한 정보를 얻기 위하여 칼모듈린 유도체($lys{\rightarrow}ile\;115$ 칼모듈린)를 발현시킬 수 있고 하이그로마이신(Hygromycin) 내성을 보일 수 있는 형질전환 담배 식물체와 하이그로마이신 내성만 보일 수 있는 형질전환 담배 식물체(대조구)가 Agrobacterium-mediated 형질전환을 통해 만들어 졌다. 이들 형질전환 담배 식물체로 부터 얻은 씨앗의 하이그로마이신 내성과 민감성에 대한 비는 예상대로 3 : 1을 보였다. Western blot과 Chemiluminescence 방법을 병행하여 형질전환 식물체($F_1$)의 잎으로 부터 칼모듈린 단백질을 검출한 결과 칼모듈린 단백질이 발현 되었음이 확인되었다. 두 형질 전환 담배 식물체로 부터 얻은 씨앗의 발아에 미치는 표피살균제의 영향을 조사해본 견과 칼모듈린 형질전환체의 씨앗은 살균수의 처리만으로도 MS 배지에서 씨앗 주변에 곰팡이 등의 오염없이 정상 발아되었으며, 대조구는 살균수와 차아염소산나트륨 용액(유효 염소 함유량 4%)을 1 : 1 배합하여 처리해주어야 오염으로 부터 벗어날 수 있었다. 칼모듈린 유도체를 발현 시키는 담배 씨앗과 대조구 담배 씨앗의 발아에 미치는 칼슘 농도의 영향을 조사해본 결과 저 농도의 칼슘을 함유한 MS배지에서는 초기 발아율에 있어 별 차이가 없었지만 고농도(예, 30mM)의 칼슘 함유배지에서는 칼모듈린 형질전환체 씨앗의 발아가 대조구 형질전환 식물체 씨앗의 발아에 비해 월등하게 잘 되었다. 이와 같은 결과들로 부터 칼모듈린 유도체의 담배 세포내 발현은 각종 환경적 요인에 대한 담배 씨앗의 적응능력을 증진시키는 것으로 제안할 수 있겠다.

• Journal of Plant Biotechnology
• /
• 제40권4호
• /
• pp.198-202
• /
• 2013

환경스트레스 저항성 오이 형질전환체 생산을 위해서 오이 "Eunsung" 품종의 자엽절 절편을 Nit유전자를 포함하는 pPZP211와 pCAMBIA2300 발현벡터로 각각 형질전환된 Agrobacterium과 공동 배양하였다. 공동배양 후 형질전환체 선발, 형질전환체 유도, 신장, 유식물체 생산 등은 자엽절 절편을 이용하는 CTM방법(Jang et al. 2011)에 따라 수행하였다. 발현벡터에 따라 선발배지에 100 mg/L paromomycin을 첨가하여 선발과정을 거쳤으며, 선발배지에서 3 cm크기의 shoot를 유도한 후 PCR, Southern, RT-PCR 및 Northern분석을 통해 형질전환 여부를 확인하였다. 공동배양 한 2,547개의 자엽절 절편으로부터 105개체(4.12%)가 선발배지로부터 얻어졌으며, 그들 중 45개체(1.77%)만이 Nit유전자의 PCR product를 얻을 수 있었다. 오이 genome에 Nit유전자의 도입여부를 확인하기 위하여 45개체에 대한 Southern분석을 수행한 결과 각각 39개체(1.53%)서 확인할 수 있었으며, 이중 오직 6개체(0.24%)에서만 Nit유전자가 안정적으로 발현되고 있음을 RT-PCR과 Northern분석을 통해 확인하였다. 이러한 결과는 Nit유전자가 오이 genome에 안정적으로 도입 및 발현되고 있음을 보여 주고 있음을 알 수 있었다.

• Journal of Plant Biotechnology
• /
• 제29권2호
• /
• pp.93-98
• /
• 2002

바이러스 설사병의 원인인 VP6유전자를 감자에 형질전환 시키기 위하여 CaMV 35S promoter와 kanamycin 항생제 내성을 갖는 식물발현벡터 pMBP-1에 subcloning하고, 이 재조합 벡터를 A. tumefaciens LBA4404에 도입시킨 후, freeze haw방법을 이용하여 감자에 형질전환 시켰다. 공동배양된 감자의 잎절편은 2,4-D가 2.0 mg/L첨가된 배지에서 2일간 배양 후, 0.01 mg/L NAA, 0.1 mg/L GA$_3$, 2.0 mg/L Zeatin, 100.0 mg/L kanamycin, 500.0 mg/L carbenicillin이 첨가된 선발배지에서 재분화시켰다. 이 때 유도된 신초는 100.0 mg/L의 kanamycin이 포함된 배지에 옮겨준 후, 왕성한 생육을 위해 MS 기본배지에서 다시 배양하였다. 기내배양시 외부유전자의 도입에 의한 외형적인 변화는 찾을 수 없었으며, 형질전환체는 NPT primer를 사용한 PCR방법으로 1차선별 하였다. DIG 표지된 probe를 이용하여 total RNA를 분석한 결과 개체별로 발현양의 차이는 있었으나, 95% 이상의 안정성을 보였고, genomic DNA를 추출해 Southern blot hybridization했을 경우 1~3개의 copy수를 보임으로써 형질전환 식물체에 외래유전자인 VP6유전자가 안정적으로 도입되었음이 확인되었다.

• Journal of Plant Biotechnology
• /
• 제40권3호
• /
• pp.135-140
• /
• 2013

마커프리 형질전환 식물체 개발 방법의 하나인 무선발 형질전환은 선발마커 유전자를 이용한 도입유전자의 선발과정 없이, 연쇄중합반응(PCR)과 같은 직접 분석방법을 사용해 도입유전자가 도입된 형질전환 식물체를 개발하는 방법이다. 현재까지 감자, 담배, 알팔파, 밀, 땅콩 등 여러 작물에서 무선발 형질전환을 이용한 마커프리 형질전환체가 보고되었다. 그러나 대부분 무선발 형질전환체의 분석이 $T_0/T_1$세대에서의 PCR을 이용한 도입유전자 확인과 후대검정으로 수행되어, 유전자의 안정적 도입 확인을 위한 분자생물학적 특성평가 결과는 보고된 바 없다. 본 연구에서는 4계통의 무선발 형질전환 Bt벼에 대한 도입유전자 특성을 분자생물학적 방법으로 검정하여 유전자도입 위치, 도입유전자의 구조, 벡터 삽입여부 등의 분석 결과를 제시하였다.

• Journal of Plant Biology
• /
• 제35권3호
• /
• pp.237-245
• /
• 1992

감자 (Solanum tuberosum L. cv. Superior)에서 cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S promoter의 발현 양상 및 외래 유전자의 발현에 미치는 intron fragment의 효과를 조사하기 위하여 옥수수의 alcohol dehydrogenase 1-S (Adh1-S) intron 1의 249 base pairs 와 ${\beta}-glucuronidase$ (GUS) 유전자를 결합한, CaMV 35S/deleted Adh1 intron-GUS 구조의 유전자 전달벡터를 제조하고 이를 Agrobacterium tumefaciens를 매개로 형질전환을 유도하였다. 유전자 전달벡터인 pLS201는 17.7 kilobase pairs로서 형질전환의 초기 선별에 용이한 kanamycin 저항성 유전자와 GUS 유전자를 갖는 구조로 제조되었다. 형질전환된 개체의 조직화학적 분석 결과 CaMV 35S promoter에 의한 GUS 유전자는 모든 기관에서 발현되었고, 줄기 및 뿌리에서는 세포분열이 활발한 유관속 형성층을 중심으로 강한 발현을 나타내었다. GUS 유전자의 발현에 미치는 intron fragment의 효과를 조사하기 위하여 CaMV 35S/GUS 구조의 plasmid (pBI121)를 형질전환된 개체를 대조구하여 GUS 활성을 조사한 결과 pLS201의 잎, 줄기, 뿌리에서 각각 30, 34, 42배 높은 활성을 보여, 옥수수 탈수소 효소 유전자의 절단된 인트론이 GUS 유전자의 발현을 증가시킴을 알 수 있었다.

• Journal of Ginseng Research
• /
• 제27권2호
• /
• pp.78-85
• /
• 2003

Agrobacterium rhizognes $A_4$ Ti-plasmid를 인삼 뿌리에 도입하여 유전적으로 안정하며 반영구적으로 이용할 수 있는 형질전환된 인삼모상근 캘러스(GHC-T78)를 유도하였다. 특정 ginsenoside를 대량으로 생산할 수 있는 최적배양조건을 확립하기 위해서 먼저 모상근으로부터 캘러스의 유도하는 과정에서 BA의 단독 처리구는 auxin과 cytokinin의 혼합 처리구보다 캘러스 형성이 더 우수하였다. 인삼 캘러스 형성율은 Benzyladenine(BA)를 1 mg-3 mg/L 까지 첨가한 배지에서 가장 높게 나타났으며, ginsenoside 함량 역시 bezyladenine 단독처리구는 가장 우수하였다. 캘러스 세포의 액체배양 기간을 4주로 설정할 때 BA의 농도 역시 BA 2 mg/L로 첨가한 배지에서 가장 우수한 캘러스 생장률을 보였다. 실제로 인삼 모상근 캘러스의 생장율은 암상태에서 배양하는 것이 광상태에서 보다 다소 양호하였으나, ginsenoside의 생성에는 연속광상태에서 더 효과적임이 확인되었다. 모상근 캘러스에서 얻은 이러한 결과는 국내외 처음으로 보고되는 내용이며, 액체배양의 캘러스 세포에서 분화된 무수히 많은 단일 모상근 근모의 형성은 액체배양을 통한 특정 ginsenosid의 새로운 생산방법을 개발할 수 있도록 하고 있다.