본 연구는 2017과 2018년에 토양검정법을 이용하여 경남 지역의 논에서 ALS 저해 제초제 저항성 잡초의 발생과 분포를 조사하기 위해 수행하였다. 2012년도 제초제 저항성 잡초조사의 결과와 비교하여 볼 때 경남지역 각 시 군의 논에서 조사된 ALS 저해 제초제 저항성 발생율은 1.0%에서 66.8%로, 발생면적은 876 ha에서 49,008 ha로 크게 증가하였다. 경남지역의 ALS 저해 제초제 저항성 논잡초의 발생 면적은 울산시(8.4%), 합천군(8.3%), 함안군(7.9%), 고성군(7.9%), 하동군(7.3%), 진주시(7.2%), 창녕군(7.0%), 김해시(6.4%), 밀양시(5.5%), 부산시(4.9%), 의령군(4.6%), 남해군(4.3%), 고성군(4.2%), 창원시(3.8%), 거제시(2.9%), 양산시(1.8%), 산청군(0.9%) 및 통영시(0.4%)순이였고, 함양군에서는 제초제 저항성 잡초가 발생되지 않았다. 가장 우점한 제초제 저항성 잡초는 물달개비였으며, 그 다음으로 논피, 미국외풀, 올챙이고랭이, 여뀌바늘, 알방동사니, 벗풀 및 마디꽃 순으로 발생하였다. 제초제 저항성 물달개비는 경남지역의 대부분의 시 군에서 발생하였으나, 저항성 벗풀과 마디꽃은 김해시에서만 발생하였다. 따라서 이러한 정보는 ALS 저해 제초제 저항성 논잡초의 확산을 방지하고 효율적 관리 방안을 수립하는데 이용할 할 수 있을 것으로 판단된다.
옥수수 잎으로부터 추출한 ALS를 대상으로 하여 CHL과 IMA의 상호작용, ALS의 기질인 pyruvate 및 2-ketobutyrate에 대한 친화도, 저해양식의 차이 등을 조사한 결과는 다음과 같다. 1. ALS 에 대한 CHL의 $I_{50}$값은 100nM이었으며 IMA의 값은 $5{\mu}M$로 나타나 CHL의 ALS 저해활성은 IMA보다 약 50배 정도 높았다. 2. ALS에 대한 시험관내에서의 실험에서 두 제초제의 동시처리시 상가적인 ALS의 저해효과가 나타났으나, 상호 순차적 체계처리의 경우에서는 먼저 처리한 제초제에 의한 저해효과가 지배적으로 나타났다. 3. 제초제에 의한 ALS 활성의 저해는 시험관내에서 10분 이내에 대부분 이루어졌다. 4. ALS의 활성은 분지아미노산에 의해 저해되었는데 Val과 Leu에 의한 저해가 Ile에 의한 저해보다 크게 나타났다. 또한 이들을 동시에 혼합처리하면 0.1mM의 농도에서도 ALS의 활성이 65% 정도 저하되었다. 5. 2-Ketobutyrate를 ALS의 기질로 첨가하면 pyruvate만을 기질로 사용하였을 때보다 측정가능한 ALS 활성이 2-ketobutyrate에 의해 농도의존적으로 감소되는 경향이었다. 6. ALS의 기질인 pyruvate에 대해 CH은 비경쟁적 저해제로 IMA는 반경쟁적 저해제로 작용하였다.
Acetolactate synthase (ALS)는 가지를 가진 필수아미노산 Val, Leu, Ile의 생합성 과정에서 공통적으로 작용하는 효소이다. ALS는 서로 구조적 유사성이 없는triazolopyrimidine, imidazolinone,sulfonylurea, 그리고 pyrimidyl-oxy-benzoate 제초제들의 공통적인 작용 표적이다. 보리로부터 부분 정제한 ALS를 이용하여 새로이 합성한 triazolopyrimidine sulfonamide 유도체들의 저해 활성을 측정하였다. 활성을 가진 유도체들의 $IC_{50}$ 값은 0.5nM∼8${\mu}M$ 범위였으며, 그 중에서 탁월한 저해 활성을 갖는 것은 TP1과TP2 유도체로 $IC_{50}$ 값은 각각 0.5 nM과 1.6 nM이였다. 이 저해제들은 기존의 상품화된 제초제인 Metosulam ($IC_{50}$;3.6 nM), Flumetsulam ($IC_{50}$;126 nM), 그리고 Cadre ($IC_{50};4 {\mu}M$)에 비해 보리 ALS에 대한 저해 활성이 보다 우수하였다. 보리 ALS에 대한 TP2의 저해 활성은 반응시간이 증가함에 따라 증가하였고, 혼합형 저해 유형을 보였다. TP2와 imidazolinone 계열의 제초제인 Cadre, 그리고 되먹임(feedback) 저해제인 Leu에 대한 이중저해 (dual inhibition) 실험 결과 TP2와 Cadre의 경우는 평행한 반응속도론적 형태가 그러나 TP2와 Leu의 경우는 한 점에서 만나는 반응속도론적 헝태가 얻어졌다. 이는 TP2와 Cadre의 결합 부위가 최소한 부분적으로 중복되고 있음을 시사한다. Cys 잔기에 대한 화학적 변형은 TP2와 Cadre의 결합에는 영향을 미치지 않으나, Leu의 결합에는 영향을 미쳤다.
본 연구는 토양검정법을 이용하여 전라남도 지역 논에서 발생되고 있는 잡초발생 양상과 ALS 저해제 제초제 저항성 여부 검증 및 저항성 잡초 발생 논면적을 예측하고자 수행하였다. 2017년 전남지역 358 필지에서 채취한 토양에 발생한 잡초의 경우 생활사별로 분류한 경우 일년생 96.1%와 다년생 3.9% 발생하였고, 형태적으로 분류한 경우 광엽잡초 59.0%, 사초과 28.3%, 화본과 12.7% 순으로 발생하였다. 비록 전남에서도 시 군별 논잡초 발생 초종수와 초종별 발생율에 차이가 있으나 미국외풀, 물달개비, 여뀌바늘, 밭뚝외풀, 알방동사니, 올챙이고랭이, 올방개, 논피, 물피 등이 발생하였다. 또한 전남지역에서는 ALS 저해제 제초제 저항성 논잡초 물달개비, 올챙이고랭이, 알방동사니, 미국외풀, 여뀌바늘, 물피, 논피 7초종이 발생하였다. 비록 전남 시 군별 ALS 저해제 제초제 저항성 잡초 초종수와 발생율은 다르나 이중 물달개비, 알방동사니, 올챙이고랭이는 광주광역시를 비롯한 전남 23개 시 군에서 발생하였다. 전남지역의 ALS 저해제 저항성 발생율(51.5%)에 기초한 저항성 논잡초 발생 논면적는 91,543 ha로 평가되었다. 따라서 이러한 정보를 활용하여 제초제 저항성 논잡초 효율적 관리 방안을 수립할 수 있을 것으로 판단된다.
2010년까지 국내 논에서 설포닐우레아(sulfonylurea : SU)계 제초제들에 대한저항성잡초로 확인된 잡초들 1998년도에 충남서산 간척지 논에서 물옥잠이 확인이후 일년생 물달개비, 올챙이고랭이, 알방동사니 등 7초종, 다년생 올미, 새섬매자기 등 다년생 잡초 3초종이 발생하여 총 10초종이다. 그리고 2009년 ACCase 및 ALS 저해제들에 대한 저항성 피가 담수직파 논의 서 남부지역에서 처음 확인되었다. 초기에는 SU계 제초제들에 대한 저항성잡초들인 물달개비, 올챙이고랭이, 알방동사니 등은 하나의 논 필지에 하나의 초종들이 발생을 하였으나 최근에는 하나의 필지에 다수의 초종들이 동시적으로 발생하고 있다. 2008년도에 전국 861필지의 논에서 채취한 토양에서 발생하고 있는 물달개비 및 올챙이고랭이의 저항성 비율은 각각 42% 및 23%로 나타났다. 저항성잡초들의 생체중을 50% 억제한 농도($GR_{50}$)는 저항성 계통이 감수성 계통에 비해 수 십배에서 수 천배 높게 나타났다. ACCase 및 ALS 저해 제초제들인 cyhalofopbutyl, pyriminobac-methyl, penoxsulam 저항성 강피에 대한 저항성 계통의 $GR_{50}$은 감수성 계통에 비해 각각 14, 8, 11배나 높게 나타났다. 한국의 논에서 제초제 저항성의 다발생과 확산의 원인은 크게 잡초측면과 제초제 측면으로 구분할 수 있다. 잡초측면에서는 종자생산량과 발아율이 높은 잡초들 즉 물달개비, 올챙이고랭이 등이 저항성잡초로 변화한다. 그리고 제초제 측면은 저항성잡초 유발의 원인인 선택성이 탁월하고 약효지속성이 매우 긴 SU계 제초제들의 광범위한 사용이다. SU계 제초제들의 생산 품목들과 처리 논 면적의 비율은 각각 69%와 96%이다. 그리고 2003년까지 처리면적으로 본 선호도 10위까지 제초제들은 대부분 SU계 제초제들이 혼합된 "일발처리제"들이다. 직파재배 논에서 ACCase 및 ALS들이 혼합된 제초제들의 연용은 제초제 저항성 피를 유발하였고, 이는 피에 효과적인 SU계 제초제들인 pyrazosulfuron-ethyl 및 imazosulfuron과 무관하지 않다. SU계 제초제들에 대한 물옥잠의 저항성 계통의 $I_{50}$은 감수성 계통에 비해서 14배에서 76배 높았는데, 이는 제초제의 흡수 및 이행에 의한 차이보다는 ALS 유전자의 점 돌연변이(point mutation)에 의한 것으로 나타났다. 즉 ALS 유전자 아미노산 197번째 proline이 serine로 변화되었기 때문이다. 제초제 저항성잡초 방제로 benzobicyclone, bromobutide 등은 광엽 및 방동사니과 잡초들을 동시에 방제가 가능하다. 그리고 ACCase 및 ALS 저항성 피의 방제는 mefenacet, fentrazamide, cafenstrole로 2엽기까지 방제가 가능하다. 그러나 앞으로 국내 논에서 제초제 저항성잡초 및 관리에 대해서는 많은 문제점들을 내포하고 있다. 첫째, 현재까지 제초제 저항성 유발 약제들인 ALS 및 ACCase 저해제들의 사용량이 증가하기 때문에 제초제 저항성 잡초들은 계속 발생할 뿐만 아니라 더욱 빠른 속도로 확산할 것이다. 둘째, 미국, 유럽, 호주 등 선진국들과 같은 제초제 저항성잡초를 연구할 수 있는 전문 연구기관과 인력이 부족하다.
Acetolactate synthase(ALS)는 박테리아, yeast, 그리고 고등 식물에서 가지를 가진 아미노산 Val, Leu, Ile의 생합성에 공통적으로 관여하는 필수적인 효소이다. 최근에 개발된 sulfonylurea, imidazolinone, triazolopyrimidine, 그리고 pyrimidyl-oxy-benzoate계 제초제들은 구조적으로 상호 유사성이 없음에도 불구하고 모두 ALS를 작용 표적으로 한다. Triazolopyrimidine(TP)계의 새로운 유도체들을 합성하여 보리의 ALS에 대해 저해활성을 측정하였다. 활성을 나타낸 저해제들의 $IC_{50}값은 3.2nM-0.62mM로 몇 개의 유도체는 뛰어난 활성을 보였다. 보리 ALS에 대해 triazolopyrimidine 유도체 TP4의 저해활성은 반응 시간이 증가함에 따라 증가하였고, 혼합형 저해유형을 보여주었다. TP4와 imidazolinone 제초제인 Cadre, 그리고 feedback 저해제인 Leu에 대한 dual inhibition 실험 결과 모두 평행한 kinetic pattern이 얻어져 이들 저해제의 결합 부위가 최소한 부분적으로 중복되는 부분이 있음을 시사했다. ALS의 Tyr의 변형은 TP4에 의한 저해 효과를 감소시키는 반면 Trp과 Cys 변형은 TP4의 결합에 영향을 나타내지 않았다.
본 실험은 한국 논에서 발생하고 있는 물옥잠의 SU계 제초제에 대한 저항성 메카니즘을 구명하기 위하여 ALS 활성, $[^{14C}]$bensulfuron의 홉수이행 및 ALS 유전자의 DNA 염기서열을 분석하였다. 한국 논에서 광범위하게 사용 중인 6 종류의 SU 계 제초제들에 대하여 저항성이 확인되었는데, 저항성 생태형에 대한 생체중 50% 저해 제초제 농도 $(GR_{50})$는 감수성 생태형에 비하여 약 4배에서 64배까지 높았다. SU계 제초제들 에 대한 저항성 생태형의 ALS 활성은 감수성 생태형 보다 훨씬 덜 민감하게 반응하였으며, 저항성 생태형에 대한 SU계 제초제들의 $I_{50}$값은 감수성 생태형 보다 14배에서 76배까지 높게 나타났다. 생태형간 ALS 활성 차이의 원인을 구명하기 위하여 $[^{14C}]$bensulfuron의 홉수이행 차이를 조사한 결과 생태형간 뚜렷한 차이가 없는 것으로 나타났다. 그러나 저항성 및 감수성 생태형의 ALS 유전자 염기서열을 분석한 결과 저항성 생태형의 ALS 유전자 아미노산 서열 중 각각 하나의 염기치환에 의하여 168번째 threonine이 serine으로, 189번째 histidine이 arginine로, 247번째 aspartic acid가 glutamic acid로 변이 된 것이 확인되었다.
제초제(除草劑) cyhalofop, pyrazosulfuron 및 pyribenzoxim 혼합처리(混合處理)의 상로작용(相互作用) 기작(機作)을 구명(究明)하고자 혼합제초제(混合除草劑)의 처리(處理)에 의한 ALS 활성(活性) 저해효과(沮害效果) 및 유리(遊離) 아미노산 함량변화(含量變化)와 집방산(脂肪酸) 함량변화(含量變化)를 조사한 결과를 요약하면 다음과 같다. 1. In vitro에서 ALS 활성(活性) 저해효과(沮害效果)는 pyribenzoxim의 $I_{50}$은 물피와 너도방동사니에서 각각(各各) 4${\times}$100 nM과 5${\times}$100 nM였으며, pyrazosulfuron의 $I_{50}$은 각각 4.5${\times}$10 nM과 4${\times}$10nM로 두 제초제(除草劑) 혼합처리시(混合處理時) ALS 활성(活性) 저해효과(沮害效果)는 저농도처리(低濃度處理)에서 상가적작용(相加的作用), 고농도처리(高濃度處理)에서는 독립작용(獨立作用)을 보였다. 2. 3종류(種類) 제초제(除草劑)(cyhalofop+pyribenzoxim+pyrazosulfuron 100+10+10 g ai/ha) 혼합처리(混合處理)에 의해 너도방동사니와 물피의 valine, leucine 및 isoleucine의 함량(含量)은 58~75%, 37%, 51%씩 각각(各各) 감소(減少)하여 저해정도가 물피보다 너도방동사니에서 더 컸으며, 그 경향은 cyhalofop을 혼합(混合)하지 않은 2종류(種類)의 혼합제초제(混合除草劑) 처리(處理)에서 다소 높았으나 초종(草種) 및 제초제(除草劑) 종류(種類)에 따라 상이(相異)하였다. 3. 3종(種)의 제초제처리(除草劑處理)에 의해 총(總) 지방산(脂肪酸) 함량(含量) 및 지방산(脂肪酸) 종류별(種類別) 함량(含量)이 모두 감소(減少)되었으나 지방산(脂肪酸) 함량(含量)에 대한 3종(種) 제초제간(除草劑間)의 길항작용(拮抗作用)은 없었다.
Sulfonylurea계 제초제 pyrazoslulfuron-ethyl과 imidazolinone계 제초제 imazaquin을 대상으로 약해발생양상, dymron에 의한 약해경감효과, butachlor와의 상호작용성, ALS에 대한 혼합작용 등을 조사한 결과는 다음과 같다. 1. 제초제에 의한 벼(동진)의 생장저해증상은 pyrazosulfuron-ehtyl 처리구에서 시간이 경과되면서 회복되었지만 imazaquin 처리구에서는 회복되지 않았다. 2. 높은 농도의 pyrazosulfuron-ehtyl에 의한 벼의 약해는 dymron 혼합처리에 의하여 크게 감소되었지만, IMA에 대해서는 약해경감효과가 나타나지 않았다. 3. 혼합처리에 의한 강피의 생장억제효과는 동시 또는 체계처리 모두 동일한 경향으로 pyrazosulfuron-ehtyl과 butachlor은 길항적이었지만 imazaquin과 butachlor은 상가적이었다. 4. Pyrazosulfuron-ehtyl과 imazaquin의 ALS 효소활성 50% 저해농도는 각각 $4{\times}10^{-7}$M, $2.8{\times}10^{-6})$M 이었고 혼합처리할 경우 butachlor은 두 제초제의 ALS 저해작용에 영향을 주지 않았다. 이상의 결과를 보면 pyrazosulfuron-ethyl과 imazaquin이 공통적으로 ALS를 저해하지만 살초기작은 서로 다른 것으로 생각되었다.
Acetolactate Synthase(ALS)는 가지를 가진 아미노산 valine, leucine, isoleucine의 생합성 과정에서 공통적으로 작용하는 효소이다. ALS는 서로 구조적 유사성이 없는 최근에 개발된 sulfonylurea, imidazolinone, 그리고 trizolopyrimidine계 제초제들의 공통적인 작용표적이다. 완두로부터 분리한 ALS를 이용하여 새로 합성한 4,6-dimethoxypyrimidine 유도체들의 저해활성을 측정하였다. 가장 우수한 저해활성을 나타내는 유도체는 K11570으로 $IC_{50}$값이 0.2 ${\mu}M$이다. 완두의 ALS에 대한 K11570의 저해활성은 incubation 시간이 증가함에 따라 증가하였으며, 기질 pyruvate에 대해 혼합형 저해유형을 보여주었다. K11570와 sulfonylurea Ally, 그리고 feedback 저해제 leucine에 대한 dual inhibition 실험결과 이들 저해제의 결합부위가 최소한 부분적으로 겹치는 것으로 생각된다. Arg을 변형시킨 효소는 K11570, sulfonylurea Ally, 그리고 leucine의 저해 민감도의 변화가 관찰되었으나, Trp의 변형은 저해 민감도에 영향이 없었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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