야생주 핵다각체병 바이러스의 낮은 병원성에 대해 살충제로서의 파밤나방 핵다각체병 바이러스(Spodoptera exigua nucleopolyhedrovirus: SeNPV)의 병원성 향상을 꾀함과 동시에 재조합 바이러스가 다각체 내에 매립됨으로써 살충제로의 적용시 야외에서의 안정성을 확보할 수 있는 p10 유전자의 프로모터를 이용한 새로운 발현벡터를 개발하기 위하여 국내분리주 SeNPV의 p10 유전자 구조를 분석하였다. 그 결과, SeNPV p10 유전자의 프로모터와 구조유전자 부위를 포함한 545염기서열을 결정하여 기존에 보고된 SeNPV p10 유전자(Zuidema et al., 1993)와 비교한 결과 구조유전자 부위에서는 100%의 상동성을 보였으나 5` 및 3` flanking region의 4개의 염기서열에서 차이를 보였다. Southern hybridization에 의하여 SeNPV전체 genomic DNA상에서 p10 유전자는 Sph I 2.4Kb와 Cla I 4.0Kb 단편내에 각각 존재함을 확인하였으며, p10 유전자를 포함하는 이들 단편을 각각 클로닝하여 제한효소 지도를 작성한다.
담배거세미나방 방제를 위한 핵다각체병 바이러스와 NeemAzal-T/S의 혼합처리 효과는 다음과 같다. 인공사료에 혼합 처리하여 실내 검정한 결과 핵다각체병 바이러스$ 1$\times$10^{8}$ PIBs/ml과 NeemAzal-T/S ppm 혼합한 경우에 $LT_{50}$ 과 $LT_{95}$가 각각 1.94일과 8.33일로 다른 처리구보다 빠르게 나타났다. 핵다각체병 바이러스 $1$\times$10^{6~8}$ PIBs/ml과 NeemAzal-T/S ppm 혼합살포로 단독처리보다 $LT_{95}$에서 3일 정도의 살충기간을 단축할 수 있었다. 배추유묘에서의 병원성 검정 결과 바이러스 단독처리는 4일째의 살충율이 10.7~6.7%로 낮으나, 핵다각체병 바이러스와 NeemAzal-T/S혼합 처리시에 살충효과가 빠르고 살충율도 높게 나타났다. 특히 핵다각체병 바이러스 $1$\times$10^{8}$ PIBs/m1과 NeemAzal-T/S 75~200 ppm처리에서는 9일째에 100%의 살충율을 보였다. 핵다각체병 바이러스를 처리하지 않은 담배거세미나방 유충은 초기 235mg에서 7일째에 2,194 mg으로 9.4배의 체중이 증가하였다. NeemAzal-T/S 단독처리시에는 200 pprn에서 1,120mg으로 4.8배 체중이 증가하였으며 바이러스 단독처리에서는 $1$\times$10^{8}$ PIBs/ml에서 7.0배 증가하였다. 그러나 두처리를 혼합하면 7일째에 $SINPV1$\times$10^{4~8}$ /+NeemAzal 75~200 ppm에서 3.9~2.9배만이 증가하여 단독처리보다 체중증가가 둔화되어 혼합처리에 의한 상승효과가 있었다.
파밤나방 유충을 이용한 효율적인 SeNPV의 생산을 위하여, 파밤나방유충의 령기와 접종농도에 따른 병원성과 관련하여 바이러스 생체 증식 효율을 조사하였다. 그 결과, 파밤나방 유충을 이용한 SeNPV의 대량생산은 4령 유충에 1.0$\times${TEX}$10^{6}${/TEX} 다각체/ml 농도로 접종하였을 시 약 86.7%의 사충율과 함께 최대 바이러스 생산성을 보여 가장 효율적임을 알 수 있었다.
Neo-PPS의 누에 바이러스병에 대한 약효에 관한 시험을 통해 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 핵다각체 바이러스에 대한 약효는 무처리에 비해 2, 4 및 6시간 처리는 월등히 좋은 효과를 나타냈다. 2. 세포질다각체 바이러스에 대한 약효는 핵다각체 바이러스에서와 동일했다.
숙주범위가 서로 다른 Autographa californica NPV(AcNPV)와 Bombyx mori NPV(BmNPV)를 Spodoptera frugiperda(Sf9) 또는 Bombyx mori(BmN-4)의 세포에 동시감염(coinfection)시킨 후, 숙주범위가 확장된 재조합 바이러스를 Sf9세포에서 10종 BmN-4세포에서 2종씩 플라크 순화하여 선발하였다. 각 재조합 바이러스 DNA의 제한효소 분석결과는 한번 이상의 재조합이 일어났음을 보여주었다. 재조합 바이러스 RecB-8의 전자현미경 관찰결과는 다각체의 모양이 모바이러스인 AcNPV나 BmNPV와는 전혀 다른 정사면체 모양이었으며 또한, 모바이러스와는 달리 virion이 다각체에 거의 매립되어 있지 않은 특징을 보였다.
담배거세미나방을 인공사료로 사육했을 경우 경과일수는 약 42일(강낭콩잎 사육은 37.9일)이었고 담배거세미나방 유충 핵다각체병 바이러스의 $LC_{50}은 1,3,5령에 대해 각각 $5.04{\times}10^{2}, 4.48{\times}10^{3}, 4.52{\times}10^{4}$ 다각체/ml이었으며, $LC_{50}은 1 령은 $1.1{\times}10^{5}$ 다각체/ml에서 7.1일, 3 령은 $1.1{\times}10^{6}$ 다각체/ml에서 7.7일, 5령은 $1.1{\times}10^{7}$ 다각체/ml에서 7.0일로 나타났다. 1 령유충은 비교적 고농도인 $10^{5-6}$ 다각체/ml로 접종했을 때 2-4령기, 3 령의 경우는 $10^7$ 다각체/ml 농도에서 100% 치사되었고, 병사충은 5 령때 발생했다. 담배거세미나방은 A. californioca MNPV, S. littoralis MNPN 및 T. ni MNPV에 의해 병원성이 나타났으며, $1.1{\times}10^{7}$ 다각체/ml로 접종했을 때 각각 92.0, 92.0, 60.0%의 사충율을 보였다.
흰불나방의 미생물적 방제를 위한 핵다각체병 바이러스의 제제화와 그 실용화를 위한 야외 살포 시험을 통해 얻어진 제제의 불활화 정도 및 살포효과는 다음과 같다. 흰불나방 핵다각체병 바이러스의 불활화 조사에서 부유액의 경우 야외 살포후 5일이 경과한 후로는 완전히 불활화 되었으며, 제제는 살포 후 20일이 지나서 완전히 불활화 되어, 흰불나방 핵다각체병 바이러스를 제제화 했을 때 부유액에 비해 약 10-15일 정도 활성을 보유하여 제제의 안전성을 확인하였다. 또 제제의 야회 살포효과 시험에서 부유액의 경우는 2일이 경과하면서 병원성을 보이지 않은 반면에 제제는 접종당일 살포하였을 때 약 50%정도의 폐사율을 나타내었으며, 살포 후 9일까지는 약 30% 정도의 폐사율을 유지하면서 비교적 안전성을 보이다가 살포 후 14일이 경과하면서 병원성을 보이지 않았다. 제제의 경우 야외에서 약 10일 이상 감염력의 지속에 의한 살포효과를 나타내었다.
곤충 바이러스인 Baculoviridae의 subgroup A에 속하는 핵다각체병 바이러스는 미생물 살충제로서, 또는 유용물질의 생산을 위한 발현벡터로서 현재 널리 연구·이용되고 있다. 본 연구에서는 이러한 NPV중 국내에서 분리된 SeNPV의 다각체 단백질 유전자의 구조적 특성을 구명함으로써 새로운 발현벡터를 제작하고자 하였다. 이를 위해 SeNPV의 다각체 모양을 전자현미경으로 관찰하고, 다각체 단백질의 분자량과 그 유전자의 구조를 각각 SDS-PAGE 및 염기서열 결정법에 의해 결정하였다. 그 결과, SeNPV의 다각체는 분자량 30 kDa의 단일 단백질로 이루어진 부정형의 구조였으며, 다각체 단백질 유전자의 염기서열을 포함한 876 염기의 서열을 결정하였다. 또한, SeNPV 전체 DNA상에서 다각체 단백질 유전자는 Xho I 3.0 Kb와 Nco I 6.0 Kb에 각각 존재함을 확인하고, 각각 cloning하여 제한효소 지도를 작성하였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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