79종의 식물재료의 Alternaria alternata에 대한 항균활성을 조사한 결과, 7가지 식물재료가 항균활성이 있었고, 11가지는 확실치 않았으며, 나머지 61가지는 항균활성이 나타나지 않았다. A. alternata에 항균활성이 나타난 7가지 식물재료 중 계피가 활성이 가장 높았으며, 오미지와 천궁이 중정도의 활성을 보였으며, 나머지는 약한 활성을 나타내었다. 항균 활성 성분은 계피와 천궁의 경우는 diethyl ether에 분리되었고, 오미자의 경우는 butanol에 분리되었다. 계피의 diethyl ether 추출물은 1,000 배액 이하에서 식별 가능한 항균활성이 나타났다. 계피의 성분으로 cinnam aldehyde가 가장 높은 활성을 보여, 이 물질이 계피의 주요 항균물질로 사료된다.
식품의 항균물질 분리에 있어 여러 가지 방법이 있지만 오차와 손실이 많아 실용화 하기에는 많은 문제점이 있다. 현재 일반적인 분리법으로 유기용매분획법, 크로마토그래피 등이 있으나, 많은 시간과 노력을 필요로 하며 시료에 따라 항균활성이 소실되는 경우가 많다. 본 연구는 전편의 '부추의 미생물학적 항균활성 특성과 가공식품에의 응용'에 이어 부추의 항균활성 물질을 효과적으로 분리하기 위한 방법을 정립하고 항균활성 물질을 확인하였다. 부추의 항균활성 물질 분리를 위하여 ultrafiltration, liquid-liquid extraction, TLC, HPLC 순으로 정제하였다. Ultrafiltration 결과 항균물질은 분자량 5,000 dalton 이하의 저분자 물질이었고, TLC로 분리된 8개의 spot중 대조군에 비하여 높은 항균활성을 나타내는 1개의 spot을 추출하여, HPLC로 유효 peak 2개를 얻었고 각 peak성분을 GC/MS로 확인한 결과 cis-propenyl methyl disulfide, 5-methyl methylthiosulphonate, dimethyl disulfide등의 황화합물로 구성된 복합물질로 확인되었다.
항균물질을 생산하는 방선균 KGT-37를 인삼밭 토양에서 분리하여 배양액으로부터 항균물질을 분리하고 silica gel column chromatography, preparative TLC, HPLC로 정제하였다. \ulcornerH-\ulcornerH COSY, HMQC, HMBC등 NMR 분석결과 KGT-37이 생산하는 항균물질은 cyclic depsipeptide계의 항생물질인 echinomycin으로 동정되었으며 이 연구에서 지금까지 assign되지 않았던 \ulcornerH과\ulcornerC의 NMR signal이 완전히 assign되었다. 이 항균활성물질은 감자더뎅이병균인 Streptomyces scabies과 Corynebacterium lilium을 포함하는 그람 양성 세균에 특히 강한 항균활성을 보였으며, 도열병균 및 점무늬낙엽병균 등 병원곰팡이에도 항균활성을 나타내었다.
어린돼지의 분변으로부터 Salmonella paratyphi에 강한 항균활성을 나타내는 균주를 분리하여, 이 균주를 Lactobacillus sp. KJ-5로 동정하였다. Lactoba C cillus sp. KJ-5 배양액의 항균활성은 균주의 성장에 비례하여 증가하여 정지기에서 최대를 나타냈으며, 최적 항균활성을 위한 배양온도는 $37^{\circ}C$로서 균주의 최적 성장온도와 통일하였다. Lactobacillus sp. KJ5 배양여액의 pH를 6.2로 조정한 경우 항균활성이 약간 감소하였으나, catalase 처리에 의해셔는 항균 활성에 아무런 영향이 없었으므로 배양중에 생성된 산이나 H101 이외의 물질이 항균활성에 관여함을 알 수 있었다. 배양여 액으로 부터 methanol과 acetone 추출에 의하여 S. paratyphi어l 항균활성을 냐타내는 항균물질을 부분정제하였다. 부분정제된 항균물질은 thin-layer chromatography에서 3개의 물질로 분리 되었으며, 이중에 하나가 항균활성을 나타내었다. 또 한 부분정제된 항균물질은 270nm에셔 최대 uv 흉 광도를 나타내였으며, 단백질 가수분해 효소의 처리 에 의하여 완전히 불활성화 되었다. 따라서 Lactob$\alpha$ C cillus sp. KJ-5가 생성하는 항균물질은 저분자량의 단백질일 것으로 추정된다.
자연계로부터 Vibrio sp.에 항균활성을 갖는 균을 검색하여 분리하고 분리균의 동정결과 Pseudomonas aeruginoso로 동정되었으며, 분리한 균의 항균성 물질의 최적 생산조건을 검토하며, 항균성 물질을 정제하여 그 안정성과 항균작용기작에 대해 조사한 결과 pH와 열에 대한 광범위한 안정성을 보였으며, 항균물질이 V. cholerae non-O1 ATCC 25872 세포에 대해 뚜렷한 용균작용을 하는 것을 관찰하였다.
식물병원균에 대한 Helicosporium 의 항균작용을 확인하기 위하여 식물병원균인 Rhizoctonia solani, Rhizoctonia solani AG2-2, Fusarium oxysporium, Phytophthora dreschler, Alternaria 속을 선정하였고, 이에 대한 항균작용을 검토한 결과, Rhizoctonia solani, Rhizoctonia solani AG2-2 에는 강한 항균활성을 나타내었으며, Alternaria에는 미약한 항균활성을 가졌으며 Fusarium oxysporium, Phytophthora dreschler에 대해서는 항균활성을 하지 않는 것으로 확인되었다. 이 항균물질의 구조를 $^1H-NMR$ 스펙트럼을 통해서 분석한 결과 이 물질은 콜레스테롤 에 해당하는 구조를 가진 것으로 추정된다.
전통발효식품으로부터 L. monocytogenes ATCC 19114에 강한 항균활성을 보이는 균주를 분리하였다. 분리된 균주의 형태학적 및 생화학적 특성과 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 Lactobacillus salivarius LCH1227으로 동정되었다. L. salivarius LCH1227이 분비하는 항균물질은 L. monocytogenes 뿐만 아니라 vancomycin-resistant Enterococcus faecalis, Streptococcus agalactiae, Bacillus cereus, Lactobacillus fermentum 등과 같은 그람양성 세균에 대해 폭 넓은 항균 활성을 나타내었다. L. salivarius LCH1227의 생육에 따른 항균 활성을 측정한 결과, 생장정체기 초기에 최대 활성(300 AU/mL)을 나타내었고, 생장정체기 이후부터 활성이 점차 감소하였다. 항균물질의 활성은 pH 2-12 구간에서 비교적 안정하였으며, 열처리에 의해서도 활성이 소실되지 않아 열에 안정한 물질임을 알 수 있었다. L. salivarius LCH1227이 생산하는 항균물질은 단백질 분해효소 처리 후에 활성이 실활됨으로써 단백질성 물질인 것으로 추정되었으며, Tricine-SDS-PAGE 실험을 통하여 항균물질의 분자량은 약 5 kDa 정도임을 알 수 있었다.
매실추출물의 항균력을 조사한 결과, $250{\mu}g/mL$ 이상의 농도에서 뚜렷한 항균활성을 보였고, 광역의 병원성 및 부폐성 미생물들에 대하여 항균활성을 나타내었다. 또한, 매실추출물의 항균물질은 넓은 범위의 온도$(40{\sim}120^{\circ}C)$ 및 $pH(3{\sim}11)$에서 안정성을 나타냈다. 따라서 매실추출물의 항균물질은 항균활성이 높고, 항균 spectrum이 광범위할 뿐아니라, 넓은 범위의 온도 및 pH에 안정하여 이상적인 천연 항균제로시의 개발가능성을 제시하였다. 아울러, 매실추출물의 항균작용을 조사한 결과, 매실추출물에는 두 종류 이상의 항균물질이 존재하며 이 물질들의 상승작용으로 항균활성을 나타냄을 확인하였다 매실추출물의 항균활성은 친수성 성분임을 확인하였으며, 항균물질의 주요 작용기작은 세포막 perturbation에 기인한 것으로 사료되었다.
천연 항균활성 물질에 관한 대부분의 연구는 약품의 제조와 첨가물로서의 이용을 목적으로 하였으나, 물질의 효용면에서 연구결과를 실용화시키기에는 미흡한 실정이다. 이러한 사실은 천연물질의 항균성을 실제 식품에 이용하는 덴 필요한 가공적성의 연구가 따르지 못한 것이 주요한 이유라고 여겨진다. 본 연구는 우리나라 사람들이 즐겨먹는 부추의 항균활성을 연구하되, 식품에 이용할 수 있도록 항균물질의 특성규명과 더불어 가공적성을 평가하여 실제 적용하는데 목적을 두었다. 생부추즙을 agar diffusion method로 항균활성을 측정한 결과는 Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Stayhlococcus aureus, Pseudomonas fluorescens. E. coli O157:H7 등의 세균류와 효모인 Pichia membranaefaciens등에 항균작용을 나타내었다. 생부추 착즙과 생부추 동결 후 착즙한 시료에서만 항균활성을 나타내었고 착즙한 후의 동결저장 시료나 데친 시료에서는 항균활성이 소실되었다 한편 여과와 원심분리 및 진공농축 그리고 pH변화 등에 의해서는 항균활성의 변화가 없었다. 항균활성 기초자료에 근거하여 가공식품의 모델로서 부추 마쇄시료를 첨가한 두유와 두부 및 냉면육수를 제조하여 식품응용 시험을 한 결과 부추를 첨가한 각각의 제품에서 미생물 성장 저해효과가 나타났으며, 특히 냉면육수의 경우 인위적으로 Bacillus cereus를 접종시켰음에도 불구하고 1$0^{\circ}C$, 20시간 저장시 부추를 첨가한 육수에서 미생물이 완전히 사멸되는 효과를 얻을 수 있었다.
약용식물인 도꼬마리 추출물을 사용하여 유산균을 이용한 단일 및 복합배양을 통하여 새로운 기능성 물질의 생산을 검토하였다. 도꼬마리 추출물의 유산발효 시 단일배양 결과에서 유산생산을 통해 대체로 잘 증식하는 것이 확인되었으며, H. pylori의 항균 활성은 단일배양보다 복합배양 시 항균활성이 아주 우수하였다. 항균성 물질의 분리는 $C_{18}$ Seppak cartridge에 흡착시켜 30% methanol 용출획분에서 항균성물질이 확인되었으며, TLC로 분석한 결과 $R_f$ 0.46의 위치에서 항균성 물질을 확인하였다. 도꼬마리 유산발효액의 항산화활성은 총 polyphenol 함량 및 radical 소거능을 검토하였으며, 그 결과 총 polyphenol 함량은 미발효시에 비해 도꼬마리 추출물의 저농도에서 단일배양의 경우 2~4배 증가하였으며, Lactobacillus brevis KCTC 3498과 Lactobacillus helveticus KCTC 3545를 복합배양한 경우 1 mg/mL 첨가농도에서 polyphenol이 가장 높게 나타났다. Radical 소거능은 도꼬마리 추출물을 0.1 및 0.5 mg/mL로 첨가하여 발효하였을 때 30~40%의 scavenging이 확인되어 발효를 하지않았을 때 (25%)보다 발효를 하였을 때 높아지는 것으로 나타났다. 특히 Lactobacillus casei KCTC 3109의 경우 0.1 mg/mL의 농도에서 70%의 scavenging을 나타내었다. 이들 결과로부터 도꼬마리 추출물의 유산발효는 미발효시에 비해 Helicobactor pylori에 대한 항균활성물질의 생산과 기능성물질인 항산화물질의 생산성이 우수하다고 사료되었으며 천연한약재의 발효를 통한 천연물 신약 등 신기능물질의 생산가능성을 확인하였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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