한천분해효소(agarase)는 기초과학영역, 한천유래 고기능성 올리고당의 생산, 해조류를 이용한 바이오에너지 생산 등에 사용될 수 있다. 본 연구진은 2012년에 한천의 분류, 기원, 생산 및 응용에 관하여 총설하였다. 이에 본고에서는 2012년부터의 agarase 재조합 발현에 대해 총설하고자 한다. Agarase의 재조합 발현에 사용된 유전자는 Agarivorans 속(genus) 세균, Flameovirga 속 세균, Pseudoalteromonas 속 세균, Gayadomonas 속 세균, Catenovulum 속 세균, Microbulbifer 속 세균, Cellulophaga속 세균, Saccharophagus 속 세균, Simiduia 속, Vibrio 속 세균 등의 19종의 세균들에서 유래하였다. 47개의 재조합 발현된 agarase 중에서 α-agarase는 2개였고 나머지는 모두 β-agarase 였다. α-Agarase는 모두 agarotetraose (A4)를 생산하였고 β-agarase는 NA2부터 NA12까지 다양한 산물을 생산하였다. 최적온도는 25~60℃, 최적 pH는 3.0~8.5의 범위였다. 50℃ 이상의 최적 온도를 갖는 agarase는 14개로 이들은 한천을 가열한 후에 졸상태가 유지되는 온도에서도 활발한 활성을 보일 것이다. CBM (carbohydrate-binding module)의 조작 등의 인위적 돌연변이로 agarase의 열안정성 증가, 최적온도와 활성의 동시 증가에 관한 연구 사례도 있었다. 재조합발현의 숙주로 E. coli, B. subtilis, S. lividans, S. cerevisiae 등이 활용되었으며, agarase 유전자의 분비신호, 다른 생물의 분비신호 및 riboswitch가 agarase의 재조합 발현에 사용되었다. Agarase를 정제한 후에 아미노산 서열에 기반한 유전자 재조합 이외에도 게놈서열 파악과 유사성 비교를 통해 putative agarase와 메타게놈에서 유래한 agarase의 재조합 발현에 관한 연구도 있다. 이러한 연구들은 향후 agarase 및 agarase를 이용한 한천분해산물의 응용 분야 등에 활발하게 이용될 것으로 기대된다.
Bacteroides fragilis의 임상 분리균주 45주의 cefaclor, ciprofloxacin, imipenem의 3종 항균제에 대한 감수성 검사를 기존의 한천 평판희석법과 최근 새로이 개발된 E-test (AB Biodisk, Slona, Sweden)법으로, brain heart infusion, Mueller-Hinton, Wilkins Chalgren 한천 배지 3종류를 사용하여 균의 최소발육 억제 농도 (MIC : Minimal Inhibitory Concentration)의 결과를 비교, 관찰하였으며 5종의 quinolone 제제 (ciprofloxacin, enoxacin, norfloxacin, ofloxacin, pefloxacin)에 대한 Bacteroides fragilis group 60주의 시험관내 감수성 검사를 한천 평판 희석법으로 실시하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 한천 평판 희석법에서 관찰된 MIC를 기준으로 E-test MIC의 결과를 비교하면 실험균주 90.3%가 한천 평판희석법의 MIC (within${\pm}$1 dilution)와 일치하여 E-test가 B. fragilis의 항균제 감수성 검사법에 한 종류로 유용한 것으로 생각되며 사용된 배지에 따른 감수성상의 양상은 큰 차이를 관찰할 수 없었으며 B. gragilis의 항균제 감수성 검사용 기본 배지로 brain heart infusion배지와 Wilkins Chalgren배지는 적합하나 Mueller-Hinton배지는 부적합 한것으로 나타났다. Bacteroides fragilis group 60주에 대한 5종의 quinolone제제에 대한 감수성상은 ofloxacin을 제외한 약재에 대해 대부분 내성을 띄었으며 균종간의 감수성상의 두드러진 차이는 관찰되지 않았다.
식품첨가제, 안정제 등으로 널리 쓰여지고 있는 한천을 신소재로서의 기능성을 밝히기 위하여 제주 우도산 우뭇가사리로 부터 한천을 열수 추출하여 품질 및 용액특성을 검토하였다. 제주 우도산 우뭇가사리로 부터 한천의 추출수율은 $32.7\%$, agarose와 agaropectin의 함량비는 79 : 21이었고, gel화능은 $0.2\%$ 및 jelly 강도는 $413.8 dyne/cm^2$이였다. 한천용액은 비뉴우톤 유체의 거동을 보였으며, 농도가 높아짐 에 따라 pseudoplastic 특성을 나타내었다. $0.5\~5\%$의 농도범위에서 한천용액의 항복력은 온도 $80^{\circ}C,\;60^{\circ}C$ 및 $50^{\circ}C$에서 각각 $0.09\~1.21\;dyne/cm^2,\;0.12\~5.29\;dyne/cm^2$ 및 $4.84\~58.37\;dyne/cm^2$의 범위로 농도가 증가할수록 그 값이 증가하였으며, 온도가 낮을수록 농도에 크게 영향을 받았다.
전남 서남해안에서 생산되는 수출용 해조가공품인 마른미역, 마른다시마, 찐톳, 마른김, 마른파래, 한천을 시료로 하여 Dietary Fiber의 함량, 보수성 및 밀도를 측정한 결과는 다음과 같다. 1. Dietary Fiber 중 Neutral Detergent Fiber는 찐톳이 41.52%로 가장 많고, 한천이 0.05%로 가장 적었으며, Acid Detergent Fiber도 찐톳이 26.20%로 가장 많고, 한천이 0.01%로 가장 적게 나타났다. Lignin은 찐톳이 6.94%로 가장 많고, 마른김과 한천은 거의 존재하지 않았으며, Hemicellulose는 마른김이 25.79%로 가장 많고, 한천이 0.04%로 가장 적게 나타났다. 또한 Cellulose는 찐톳이 19.26%로 가장 많고 한천이 0.01%로 가장 적게 나타났다. 보수성은 마른미역이 $16.6g{\cdot}waer\;/\;g{\cdot}A.D.P$로 가장 큰 값을 보였고, 기타 시료는 $6.1{\sim}8.5g{\cdot}water\;/\;g{\cdot}A.D.P)$로 비슷하였으며, 침지시간 및 입자크기별 보수성의 변화는 크게 나타나지 않았다. 밀도는 Direct density가 $500{\sim}806mg/ml$Bulk density가 $0.562{\sim}0.833g\;/\;cc$Hydrated density가${1.4{\sim}2.01g\;/\;ml$Hydrated volume expansion이$102{\sim}160%$였으며, Direct density와 Bulk density의 값은 대체로 상응하였다.
최근 플라즈마 의학이 발달하면서 제트, 펜, 니들, 토치 등의 다양한 형태의 플라즈마 발생기가 개발되었으며 내부의 가스라인으로 가스의 종류, 유속, 조성 등을 조절하여 생물학적 효과를 극대화 할 수 있고 안정적으로 플라즈마 방전상태를 유지할 수 있으나 처리 면적이 좁아 실제 생물학적 시스템 (세포, 조직, 그리고 박테리아) 적용에 있어 한계점이 존재한다. 이러한 한계점을 극복하기 위해서 유전체격벽방전 (Dielectric barrier discharge, DBD) 방식을 이용한 플렉서블 활성종 발생기를 제작하고 생물학적 시스템에 적용하기 위한 방전 특성 평가를 진행하였으며, 간단한 in vitro 모델인 한천 젤을 이용하여 플라즈마 처리에 따른 전달물질의 침투거리를 확인하였다. 플라즈마 방전 시 생성되는 수산화기 [OH], 과산화수소 [$H_2O_2$], 초산소음이온 [$O_2{^-}$], 오존 [$O_3$], 그리고 산화질소 [$NO_x$]와 같은 산소 및 질소 활성종 (Reactive oxygen and nitrogen species, RONS)은 세포벽 또는 세포막의 주요 구성성분인 다당류와 인지질의 과산화 반응을 통해 구조를 변화시키고 생물학적 시스템의 표면의 pH를 낮춘다. 이러한 RONS의 작용은 살균, 소독 뿐만 아니라 약물의 침투를 돕는다. 일반적으로 한천 겔은 농도에 따라 생체 내 뇌 조직과 물리적 특성이 유사하고, 미생물학 기질, 방사선학 연구를 위한 조직모델로 사용되기 때문에 본 연구에서는 3%와 5% 농도의 한천 젤을 사용하여 침투거리를 확인하였다. 한천 젤은 $2.5{\times}2.5{\times}2.5cm^3$의 크기로 준비되었고 대조군으로 염료가 포함된 에멀젼을 0.01 g 도포하고, 실온에서 30분간 보존 후 단면을 잘라 현미경으로 침투거리를 확인하였으며, 실험군으로 플라즈마 전처리 후 에멀젼을 도포한 시표와 에멀젼 도포 후 플라즈마 처리한 시료에 대해 에멀젼 침투거리의 변화를 확인하였다. 본 연구의 플렉서블 활성종 발생기는 인체에 부착하여 사용되기 때문에 화상, 홍반을 유발을 방지하기위해 $40^{\circ}C$의 온도에서 실험을 진행하였고 이때에 플라즈마 방전조건은 $0.065W/cm^2$ 수준의 전력을 소모하는 1.7 kV의 전압, 16 kHz의 주파수로 10분간 처리하였다. 그 결과 3%의 한천 젤의 경우 침투거리 0.779 mm에서 0.826 mm, 0.942 mm까지 침투거리가 증가하였고 5%의 한천 젤의 경우 0.859 mm, 0.949 mm로 증가하였다. 이러한 침투거리 증가는 젤 표면의 다당류를 구성하고 있는 단량체가 플라즈마 처리시 화확적 구조가 끊어져 결론적으로 약물 침투가 증가된 것으로 판단된다.
참우뭇가사리 (Gelidium amansii sp.)를 원예(原藻)로 하여 추출조건( 抽出條件)(산(酸)의 종류(種類)와 농도(濃度) 및 추출시간(抽出時間) 등)에 따른 한천(寒天)의 수율(收率)과 이화학적성질(理化學的性質)을 분석(分析)하였으며, 조건별(條件別)로 추출(抽出)된 한천(寒天)에 대하여 agarose와 agaropectin의 비율(比率)을 측정(測定) 검토(檢討)하였다. 자숙중(煮熟中)에 염산(鹽酸), 황산(黃酸) 및 초산(酢酸)을 가했을 때, 추출(抽出)된 한천(寒天)의 수률(收率)과 젤리강도를 비교(比較)한 결과(結果) 염산(鹽酸)을 가하여 추출(抽出)한 것이 가장 우수(優秀)하였으며 산(酸)의 알맞은농도(濃度)는 0.005-0.01N HCI의 범위임을 알았다. 산(酸)을 첨가하지 않고 추출(抽出)한 대조구(對照區)의 수율(收率)과 젤리강도는 13.3%, $306g/cm^2$였다. 산(酸)의 종류(種類)와 농도별(濃度別)로 가장 높은 수율(收率)을 보인 추출조건(抽出條件)은 0.007N HCI의 38.7%, 0.007N $H_2SO_4$의 40.5%. 0.05N $CH_2 COOH의 42.4%였다. 그리고 가장 높은 젤리강도를 보인 추출조건(抽出條件)은 0.005N HCI일 때의 $511g/cm^2$, $0.005N\;CH_2 COOH일 때의 $463g/cm^2$, 0.01M $CH_2COOH$ 일때의 $436g/cm^2$였다. 그리고 구(對照區)와 젤리강도 및 수율(收率)이 가장 높게 나타난 산처리추출(酸處理抽出)된 한천중(寒天中) agarose의 함량이 가장 많은 것은 젤리강도가 가장 높은 0.005N HCI 처리구한천(處理區寒天)이었으며, 이때 성분(成分)과 황산기(黃酸基)의 함량은 가장 적었다.
본 연구에서는 많은 생리활성 기능을 갖는 한천올리고당과 네오한천올리고당을 생산할 수 있는 agarase를 생성하는 신규 해양성 세균을 분리하고, 이 균주가 생성하는 한천분해효소의 특성을 조사하였다. 한천분해활성을 가진 신규의 SH-2 균주는 경상남도 남해군 연안에서 채취한 해수에서 분리하였으며, 16S rDNA 염기서열분석을 통해 Marinomonas 속 세균과 약 99% 유사하여 Marinomonas sp. SH-2로 명명하였다. Agarase는 Marinomonas sp. SH-2 균주의 배양액으로부터 추출하였으며, 한천분해활성을 측정한 결과, pH 6.0의 20 mM Tris-HCl buffer를 사용할 경우 30℃에서 최고 활성(170.2 units/l)이 나타났다. 하지만, 40℃ 이상의 온도에서 0.5시간 이상 처리할 경우 효소의 잔존활성이 40% 이하로 감소하는 것으로 보아 이 효소는 내열성을 가지지 않는다고 판단되었다. 효소의 가수분해산물을 TLC로 분석한 결과, Marinomonas sp. SH-2으로부터 생성되는 효소는 아가로스를 분해하여 neoagarohexaose와 neoagarotetraose를 생성하여 β-agarase로 확인되었다. 따라서 Marinomonas sp. SH-2와 이 균주의 한천분해효소는 식품, 화장품, 의약품 연구 등에 실용적으로 적용할 수 있을 것이다.
국내산 한천원조(寒天原藻)로서 남해(南海), 완도(莞島), 여수(麗水)지역에서 수집한 꼬시레기에 대하여 전처리(前處理)방법에 따른 한천의 수율(收率)과 품질특성(品質特性)을 분석한 결과는 다음과 같다. 원조(原藻)의 전처리(前處理)과정에서 고온(高溫)알칼리 처리는 알칼리의 농도가 높을수록 수율(收率)이 증가하였으나 처리시간은 한시간이 최적(最適)이었다. 산(酸)처리에서는 산(酸)농도가 높을수록 또 처리시간이 길수록 수율(收率)이 증가하였다. 상온(常溫)알칼리 처리에서는 알칼리의 농도가 높을수록 또 처리시간이 길수록 수율(收率)이 약간씩 감소하였다. 한천(寒天)제품의 품질특성(品質特性)을 보면 전처리과정에 의하여 전질소, 조회분은 크게 감소하였다. 한천(寒天)제품의 제리강도(强度), 젤화능력(化能力), 젤화온도(化溫度), 점도(粘度)는 고온(高溫)에서 원조(原藻)의 알칼리처리조건이 강할수록 증가하는 경향이 있었으며 유황함량과 제리강도(强度)는 고도(高度)의 부(負)의 상관(相關)관계를 나타내었다. 원조(原藻)의 상온(常溫)알칼리처리는 처리조건에 따라 한천의 품질향상(品質向上)에 있어서 큰 차이가 없었으며 고온(高溫)알칼리처리와 유사한 효과(效果)를 나타내지 못하였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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