대두 7품종과 이를 이면교잡(二面交雜)해서 얻은 2대 21종의 대두에서 각각 가용성 단백질을 추출하여 Sephadex G-75에 의한 겔 여과와 polyacrylamide 겔 전기영동으로 트립신 인히비터를 분획 정제한 결과 16종의 트립신 인히비터가 검출되었고 각종류의 대두마다 $5{\sim}12$종의 트립신 인히비터가 존재하였으며 주로 5종의 트립신 인히비터가 분포하였다.
Saccharomyces cerevisiae의 class I 키틴생합성 효소인 Chsl의 활성측정법을 적용하여 Aspergillus nidulans의 영양균사에서 class I 키틴생합성 효소인 ChsC의 활성측정을 시도하였다. 그 결과, A. nidulans의 class I 키틴생합성효소도 효모류의 경우와 마찬가지로 트립신 처리에 의하여 활성화되는 효소전구체형태(zymogenic form)로 존재함을 알 수 있었다. 그리고 A. nidulans 야생형의 class I 키틴 생합성 효소활성은 트립신 처리에 의하여 6배 가량 증가되었다. 반면, chsC 유전자가 파괴된 돌연변이주는 트립신 처리에 의하여 효소활성이 증가되지 아니하였을 뿐만 아니라, 효소활성의 수준도 트립신을 처리하지 아니한 야생형의 class I 키틴생합성 효소활성과 거의 동일한 수준이었다. 따라서, 트립신을 처리하여 측정한A. nidulans 야생형의 class I 키틴생합성 효소활성 값에서 트립신을 처리하지 아니한 야생형의 class I 키틴생합성 효소활성을 제외한 값이 A. nidulans 야생형의 ChsC 효소활성임을 알았다. 이러한 조건을 토대로 영양균사 생장과정 동안 ChsC의 효소활성을 측정한 결과, chsC 유전자의 발현양상과 유사하게 액체배양상태의 영양균사가 무성분화능을 획득하는 시기로 알려진 시간대에 효소의 활성이 증가하였다. 이러한 결과는 이미 보고된 바와 같이 chs 유전자가 A. nidulans의 영양균사 생장에 관여함을 시사하고 있다.
탄수화물을 갖고 있지 않은 caseinomacropeptide (CMP)를 감성유청분말로부터 12% TCA법에 의해 분리한 결과 100 g의 감성유청분말로 부터 2.7 g을 얻을 수 있었다. 분리된 CMP는 전기영동과 아미노산 조성을 분석한 결과 매우 순도가 높은 CMP로 나타나 12% TCA침전법은 감성유청분말로 부터 CMP를 분리하는 효과적인 방법임을 알 수 있었다. 트립신을 pore glass beads에 carbodiimide (EDC) 방법으로 amide결합에 의해 고정화시켰으며 고정화된 트립신의 양은 1 g glass beads당 20 mg이었다. 수용성 트립신에 의한 CMP 가수분해는 24시간이 지나면 거의 완료되었으며 고정화 트립신은 24시간이 지난 후에도 가수분해가 진행되고 있었다. 가수분해물을 Bio-Gel P4 column에 의해 분획한 후 혈소판 응집 저해작용을 측정한 결과 고정화 트립신에 의해 24시간 가수분해시킨 CMP 분해물이 가장 높은 혈소판 응집 억제능을 보였다.
배경: 이식편을 개발함에 있어서 숙주의 면역반응을 최소화하여 보다 더 오래 사용할 수 있게 하기위한 방법으로 무세포화에 대한 연구가 시행되고 있다. 저자들은 소 심낭의 무세포화의 과정에 효소제인 트립신 전처치가 물리역학적, 조직학적으로 미치는 영향에 대해 알아보고자 하였다. 대상 및 방법: 소 심낭편을 SDS와 Triton X-100 또는 N-lauroylsarcosinate와 Triton X-100으로 무세포화하는 것을 기본으로 한 군들과 0.1% 트립신/0.1% EDTA로 전처치를 추가한 군들에서 장력 검사를 실시하고, 생체 이식 후의 상태를 가정한 피로도 검사를 전후로 하여 투과도와 유순도는 검사하였고, 피로도 검사 전후로 조직학적인 변화를 광학현미경 및 전자현미경으로 관찰하였다. 결과: 트립신 처치를 추가한군과 아닌 군에서 기계적 장벽의 차이는 없었으나, 투과도와 유순도는 피로도검사 전과 후로 트립신 처치를 하지 않은 군에 비해 증가하였으며, 조직학적으로도 세포외 기질이 더 손상된 소견을 보였다. 걸론: 소 심낭의 무세포화에서 트립신 전처치는 세포외 기질의 손상을 유발하지만 기계적 장력에는 큰 영향을 미치지 않았으며, 피로도검사 전후 모두 투과도와 유순도를 증가시켰다. 무세포화과정에서 트립신과 같은 단백질 분해 효소제를 이용하기 위해서는 조직의 생체 물리적 손상을 최소화할 수 있는 다양한 방법을 조합한 연구가 더 필요하다.
역미셀계를 이용하여 대두 트립신 저해제의 분리에 대하여 고찰한 바, 여러 완충 수용액 중에서 1.0M $C_aCl_2용액(pH3.0)과 1.0M NaCl용액(pH 11.5)이 단백질의 용해와 회수에 가장 적당하였다. 이 조건을 두 모델계와 하나의 실제시료에 적용해 본 결과, 7S 단백질과 트립신저해제로 구성된 모델계에서는 비활성이 두배이상 증가되었고, 선수용성 단백질과 트립신 저해제로 구성된 모델계에서는 1.6배의 비활성 증가를 볼 수 있었다. 광교대두로부터 추출한 전유출물의 경우, 1.56배의 비활성 증가가 있었다. 이들을 SDS-PAGE로 확인한 결과 모두 매우 순수한 단백질임을 알 수 있었다.
에테르기를 가진 수용성 포스파젠 고분자를 감마광선에 노출시켜 좋은 수분-팽윤도를 가진 친수성 겔을 만들었다. 이 친수성 겔들의 물리적 강도가 감마광선의 강도에 따라 조절될 수 있었다. 트립신과 수용성 포스파젠 고분자를 함께 감마광선에 쪼여 트립신을 겔의 망 사이로 고정시켰다. 고정된 트립신의 활성도는 N-${\alpha}$-benzoyl-1-arginine-p-nitroanilide와 반응시킨 후 분광학적인 방법으로 조사하였다. 고정된 트립신은 적어도 500시간 후에도 상당히 좋은 활성도 수율과 안정도를 가지고 있었음을 보여주었다.
GBⅠ-Ⅱ의 antielastic 고리과 LBI의 antitryptic 고리는 $P_1$ 위치의 아미노산 잔기만 차이가 있으며 나머지 모든 아미노산 잔기는 동일하다. Inhibitor의 $P_1$을 키모트립신에 효과적인 특이성이 있다고 알려진 Tyr 잔기로 치환시킨 cyclic nonapeptide와 저해작용에 필수적으로 생각되는 5개의 아미노산 잔기만으로 선정된 cyclic pentapeptide 유도체를 액상법으로 합성하였다. 이들 펩티드 유도체를 3종의 단백질 분해효소에 작용시켜 그 저해활성을 측정한 결과 cyclic nonapeptide는 키모트립신에는 저해작용이 없었고 의외로 에라스타제와 트립신에 저해활성이 있었다. 또한 cyclic pentapeptide는 키모트립신에만 저해활성이 있었다.
트립신과 키모트립신 혼합물은 분자량 및 화학적 구조가 유사하여 기존의 분리방법으로는 분리가 쉽지 않다. 그러므로 우수한 선택적 분리 기능이 있는 친화성 크로마토그래피와 막분리 공정의 장점을 결합한 유가식 분리동정이 연구 되었다. 트립신에 대하여 더 친화성이 있는 수용성 고분자와 제조된 셀룰로오스 아세테이트 한외여과막에 의해 트립신-친화성 고분자 복합체가 시스템 내에 유지되었으며, 결합되지 못한 효소들은 제거되었다. 사용된 한외여과막의 기공크기는 막 제조시 에탄올 농도에 의해 조절했으며, 친화성 고분자는 $4^{\circ}C$에서 아크릴아마이드와 N-아크리로일-m-아미노벤자미딘으로 중합에 의해 제조하였다. 트립신은 친화성 고분자와 제조된 UF-50 한외여과막을 이용하여 용출 완충용액으로 여과한 결과 순도 86%를 얻을 수 있었다.
Streptomyces griseus trypsin (SGT)을 코드하는 sprT 유전자와 그 하류에 존재하는 두 개의 조절 유전자 rsgtR1 및 sgtR2를 동시에 갖고 있는 재조합 벡터 pWHM3-TR1R2를 S. lividans TK24 및 S. griseus IFO 13350에 도입하여, 트립신의 생산성을 더욱 증대시킬 수 있는 배지를 조사하였다. S. lividans TK24/pWHM3-TR1R2의 경우 배양 5일을 기준으로 R2YE에서 가장 높은 생산성(0.74 unit/mL)을 나타냈고, C5/L. (0.66 unit/mL), Livid (0.08 unit/mL), NDSK(0.06 unit/mL) 순으로 나타났다 S. griseus IFO 13350/pWHM3-TR1R2의 경우에는 전반적으로 배양 7일에 트립신 활성이 가장 높았으며, C5/L (1.518 unit/mL), R2YE(1.284 unit/mL), NDSK (0.932 unit/mL), Livid (0.295 unit/mL) 순으로 나타났다. S. griseus IFO 13350/pWHM3-TR1R2를 C5/L 배지에서 7일간 배양한 배양액으로부터 $25%{\sim}60%$ ammonium sulfate 침전, CM-sepharose 및 Sp-sepharose column chromatography를 통하여 트립신을 고순도로 정제할 수 있었다. 최종 purification fold는 6.5배, 순수 정제된 트립신의 specific activity는 69,252 unit/mg, 회수율은 1.4%이었다.
체내 소화효소에 대한 안정성을 검토하기 위해 competitive ELISA를 이용하여 항원 결합력의 변화를 조사하였다. YIgG는 펩신에 대해 상당히 불안정하여 pH 2.0에서 30분간의 반응에 의해 항원 결합력이 소실되었다. 한편 yIgG 용액에 50%(w/v) saccharose를 첨가하여 펩신과 30분 반응시킨 결과 native yIgG에 비해 항원 결합력이 6.7배 정도 저하되었으나 미첨가시에 비해 항원 결합력이 상당히 유지되었으므로, 펩신에 대한 yIgG의 안정성은 saccharose에 의해 상당히 증가되었음을 알 수 있다. YIgG는 트립신 및 키모트립신과 반응 후 항원 결합력의 큰 저하는 나타나지 않아 펩신에 비해 상당히 안정한 것으로 생각된다. 트립신과 8시간 반응 후 yIgG의 항원 결합력은 native yIgG에 비해 2배 감소되었으나 키모트립신과 8시간 반응 후 yIgG의 항원 결합력은 1.5배 감소되었다. 그러므로 yIgG는 키모트립신 대해 가장 안정하였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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