경남지역 논 토양 곡간 및 선상지 10개소와 하성평탄지 10개소를 대상으로 2011년에 미생물 세포벽 지방산 함량을 분석하여 미생물 다양성을 주성분분석으로 해석하였다. 토양 미생물체량은 곡간 및 선상지가 $1,266mg\;kg^{-1}$으로 하성평탄지 $578mg\;kg^{-1}$ 보다 유의적으로 많았으며 탈수소효소 활성도 곡간 및 선상지가 $204{\mu}g\;TPF\;g^{-1}\;24h^{-1}$으로 하성평탄지 $93{\mu}g\;TPF\;g^{-1}\;24h^{-1}$보다 유의적으로 많았다. 논 토양 평균 미생물 군집은 곡간 및 선상지가 총 세균이 32.9%, 그람음성 세균은 17.7%로서 하성평탄지의 총 세균 30.3%, 그람음성 세균 15.2%에 비해 유의적으로 많았다. 주성분 분석 결과 토양 유기물 함량과 총 세균 군집 비율이 경남지역 논 토양의 곡간 및 선상지와 하성평탄지의 특성을 구분할 수 있었다.
1) 효모세포벽(酵母細胞壁) 용해활성(溶解活性)이 큰 미생물을 얻기 위하여 baker's yeast-peptone-bouillon agar 평판(平板)배지에서 투명하게 용해된 부위를 형성하는 균주(菌株)를 서울 및 경기지방의 토양 및 하수(下水)시료에서 156개 분리하였고 이들중 활성(活性)이 가장 큰 균주(菌株)로 K-42를 선발하여 Bacillus circulans로 동정(同定)하였다. 2) 균주(菌株) K-42에 의한 효모세포벽 용해효소의 생산을 보면 당류 첨가의 경우 배양 2일째에는 maltose>glucan>xylose>control의 순으로, 3일째에는 lactose>galactose>glucan>control의 순으로 나타났다. 무기 질소원의 경우는 배양2일째 ammonium acetat>sodium nitrate>control의 순으로, 3일째는 ammonium chloride>ammonium oxalate>control의 순으로 나타났으며 milk casein을 제외한 거의 모든 유기질소원은 배양 2일째 활성(活性)의 증가를 보였으나 3일째는 모두 감소하였다. 당류와 질소원의 배합첨가는 상승효과가 없었다. 3) 효소생산에 미치는 당류와 질소원의 첨가 효과는 배양기간 중 pH의 변화와 깊은 관계가 있었는 바 배양중 $pH\;7{\sim}8$을 계속 유지시켜 주면서 당류 또는 질소원을 첨가하면 높은 활성(活性)을 상당기간 계속 유지할 수 있었다. 4) K-42균주(菌株)가 분비(分泌)하는 세포벽(細胞壁) 용해효소의 작용최적(作用最適) 조건은 $pH\;7{\sim}8$, $60^{\circ}C$이었고 열처리(熱處理) 효모세포벽의 용해율은 65%이었다.
토양으로부터 분리된 Bacillus sp.A1 균주는 가수분해활성보다는 전이활성이 훨씬 높은 ${\beta}-galactosidase$를 생산하기 때문에 산업적 응용 가능성이 있으나, glucose에 의한 catabolite repression을 보일 뿐만 아니라 lactose를 inducer로 요구한다는 결정적인 단점이 있어 갈락토올리고당의 제조에 직접 사용하기에는 적합하지 않았다. 따라서 galactose 전이효소의 생산성 제고를 꾀하기 위하여 N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine를 이용한 3단계 변이를 시도하여 A4442변이주를 선발하였다. 이 변이주의 효소생산 능력은 괄목할 만큼 향상하였으며(약 20배 내외) catabolite repression과 lactose 요구성이 상당히 해제되었음을 확인하였다. 아울러 갈락토스가 새로운 inducer로 작용하는 것도 관찰하였다. 변이주를 이용한 발효시에 당의 농도와 배양액의 pH는 상호연관되어 효소의 생산에 영향을 끼쳤다. pH stat 기법을 이용하여 배양중 당의 농도를 0.5% 이하로 조절할 때 pH는 $6.5{\sim}7.5$ 범위내로 유지되었으며 효소활성은 $44\;unit/m{\ell}-broth$로 높게 나타났다.
전국 각지의 토양 800점에서 총 1,506주의 균을 분리하였고 이들중에서 응유효소 생산균으로 20주의 균을 선정하였으며 교실보존 균들 중의 응유효소 생산균을 선정하여 응유효소 생산력을 비교하였으며 이들중 보존균 중의 Dothiorella ribis가 비교적 우수한 응유효소생산균임을 알고 이것을 밀기울에 배양할 때의 배양조건을 검토한 결과 밀기울에 대한 산수량은 $60{\sim]80%$ 산수의 pH는 4.0 정도, 질소원으로는 $(NH_4)_2SO_4$ 0.5%, 탄소원으로는 sucrose 3%정도, 무기염으로는 0.03%, 배양온도는 $30{\sim}35^{\circ}C$, 배양기간은 4일 정도가 적당함을 알 수 있었고 보다 장기간 배양하면 생성된 응유효소의 활성이 감퇴됨을 알수 있었다.
전분의 효율적인 이용을 목적으로 토양으로부터 균체외 플루탄아제효소를 대량분비하는 약알칼리성균주 Bacillus sp. S-1를 분리하였다. 본 균주의 풀루란아제효소 생샨의 최적 pH는 6-10 사이였으며, 조효소의 가용성전분과 플루란에 대한 주요반응 최종산물은 말토트리오스로, 본 효소가 ${\alpha}$-1,6-glycosidic 결합에 특이적임을 알 수 있었다. 본 균주는 지금까지 알려진 알칼리성균주들의 플루란아제 생산성보다 월등히 높은 7.0U/ml를 생산하였으며, 정제효소의 최적 pH와 온도는 각각 8.0-10.0와 50-60$^{\circ}$C로서 알칼리성 및 호열성의 특성을 나타났었다. 또한 정제효소는 pH12에서도 약 10%의 활성을 유지하며, 넓은 pH범위에서도 안정하였다. 이러한 결과들은 본 균주가 플루란아제 생산균주로서의 이용가능한 잠재력을 보유하고 있음을 시사하였다.
토양으로부터 분리한 방선균주로부터 새로운 type II 제한효소를 분리하여 그 특성을 연구하였다. 이 균주는 수리분석 결과, Streptoverticillium olivoverticillatum으로 동정되었으며, 정제한 제한효소는 SolI이라 명명하였다. SoII은 BamHI의 isoschizomer로서 여섯 개의 염기서열 5'-G $\downarrow$ GATCC- 3'을 인지하며 두 개의 G 염기 사이에서 절단하여 4 base가 돌출된 5'말단을 생성한다. 그러나 BamHI과는 달리, dam methylation 되어 있는 인식 염기서열에는 작용하지 못하였다. Ammonium sulfate 분획(30-65%)과 heparin-agarose, Affi-gel Blue column chromatography를 거쳐 SolI을 부분 정제하였다. SolI은 활성을 보이기 위하여 0.2mM 이상의 $MgCl_2$를 반드시 필요로 하였으며, 다른 cofactor는 요구하지 않았다. NaCl이 없을 때 가장 높은 활성을 가지며 120 mM 이상의 NaCl이 있으면 활성이 완전히 억제되었다. 이 효소의 반응 최적 온도는 $40^{\circ}C$, 최적 pH는 8.6으로 나타났다. Gel filtration chromatography에서의 용출부피 비교로부터 이 효소의 분자량은 약 43,000Da인 것으로 추정된다.
보존균 141주와 토양분리군 41주의 균체 외 phytase 생산능력을 조사한 결과 일반적으로 곰팡이류가 높은 효소활성을 나타내었으며 이중에서 효소활성이 가장 높은 균주를 선별하여 그 형태학적 특성을 조사한 결과 Aspergillus sp. 로 동정되었다. 아울러 분리균주의 효소생산을 위한 배양조건을 연구하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. 34$^{\circ}C$에서 3일간 전배양한 종균으로 28$^{\circ}C$에서 5 일간 본배양하였을 때 최고의 효소활성을 나타내었다. 2. Phytase생산배지의 초기 최적 pH는 2부근이였다. 3. 탄소원으로서는 일반적으로 galactose를 구성단위로 가진 당류는 비효과적인 반면 glucose를 가진 당류가 더욱 효과적이었다. 특히 sucrose가 가장 양호한 결과를 나타내었다. 4. 무기질소원으로서는 KNO$_3$가 가장 적합하였으며. 무기인산함량이 많은 인산암모늄이 가장 불량하였다. 5. 유기질소원은 0.2%의 corn steep liquor를 첨가했을 때 가장 효과적이었다. 6. KCl, MgSO$_4$, 및 무기인의 최적농도는 각각 0.5g/$\ell$, 0.5g/$\ell$및 40~80mg/$\ell$였다. 한편 고인산배지에서는 균체증식은 현저히 증가되나 효소합성은 현저히 감소됨을 보였다.
식물 병원성 사상균 세포벽의 주성분인 chitin을 분해하는 미생물을 토양에서 분리, 선발하여 동정하고 이들의 효소적 성질을 조사하였다. 선발균 Serratia (S) marcescens는 식물 병원성 사상균인 Fusarium (F) axysporum과 Rhizoctomia (R) solani에 대해 길항력은 갖고 있었으며 효소적으로 chitinase 외에 laminarinase 및 protease 등의 활성을 가지고 있었다. 선발 균주의 chitinase 생산 최적조건은 chitin broth 기본배지의 조성과 온도 및 배양시간을 변형하여 조사한 결과 colloidal chitin 1.5%, tryptone 0.5%, glucose 1%, peptone 0.2%, $MgSO_4{\cdot}7H_2O\;0.1%,\;K_2HPO_4\;0.1%,\;NaCl\;0.1%$ (w/v), pH 6.8 배지에서 $30^{\circ}C$, 72시간 배양하였을 때이었으며 효소의 in vitro 최적 활성조건은 pH 7.5, $50^{\circ}C$이었다. 한편 여러 무기이온 중에서 $Ag^+$와 $Mn^{++}$은 효소의 활성을 촉진시켰다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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