본 연구에서는 한국산 생약재인 마황과 복분자를 이용하여 추출과정 중 4$0^{\circ}C$, 6$0^{\circ}C$, 10$0^{\circ}C$로 온도를 달리 하여 기존의 열수 추출방법과 초음파를 병행한 추출을 통하여 면역활성 증진에 다르게 나타나는 효과를 비교 실험하였다. 추출시 모든 열수 추출물들에 비해 초음파 병행 추출물의 추출 수율이 높게 나타났고, 마황 4$0^{\circ}C$ 초음파 병행 추출물이 물 추출물에 비해 2.34배로 가장 높은 추출 수율이 나타냈으며, 10$0^{\circ}C$ 복분자 추출물은 물 추출물에 비해 초음파 병행 추출물이 1.27배 증가한 것으로 나타나 10$0^{\circ}C$ 복분자 추출물을 제외한 모든 추출물들에서 초음파 병행 추출물이 물 추출물에 비하여 1.6배 이상 증가한 것으로 나타났다. 이는 추출시 추출되지 않았던 여러 활성 물질이 초음파 처리에 의해 액체간의 상호 탈기 작용에 의해 추출 수율의 상승 효과를 가져온 것으로 사료된다. 또한, 면역세포의 생육활성 측정결과 모든 조건에서 초음파 병행 추출물이 열수 추출만을 가한 추출물에 비해 생육도가 20∼25% 가량 더 높게 관찰되었다. 더불어 인간 면역세포인 B, T cell을 이용한 cytokine 분비량 측정실험에서도 마찬가지로, 열수 추출물에 비해 초음파를 병행한 추출물에서 그 분비량이 1.5배 정도 더 높게 나타났다. 그 중에서도 복분자 6$0^{\circ}C$, 40 KHz 초음파 병행 추출물이 가장 높은 cytokine 분비량 증가 효과를 나타내었다. 이러한 결과를 비추어 보면, 앞으로 더 많은 실험을 통하여 초음파의 병행 효과와 이를 통한 기능성 소재 및 기능성 식품으로의 고부가가치 창출을 위해 더 많은 연구가 이루어져야 할 것으로 생각되어진다.
최근 매실나무를 기주로 한 겨우살이의 인공재배에 성공함에 따라, 식 의약품과 화장품의 소재 및 산업화 가능성을 확인하기 위해 80% 에탄올 및 증류수 초음파추출물의 총 폴리페놀 플라보노이드 함량 및 DPPH free radical 소거능을 측정하였다. 경기도 남양주시에서 인공재배한 매실나무겨우살이(동결건조) 및 강원도 홍천에서 채취한 자연산 굴참나무겨우살이(열풍건조, $30^{\circ}C$, 7day)의 80% 에탄올, 증류수 초음파추출물에 대한 총 폴리페놀 및 플라보노이드함량 그리고 DPPH free radical 소거능을 측정한 결과, 시료의 농도에 비례하여 총 폴리페놀과 플라보노이드 함량 그리고 DPPH free radical 소거능이 증가하였다. 총 폴리페놀 함량은 매실나무겨우살이의 80% 에탄올 추출물이 5,000ppm에서 $192.63{\mu}g/ml$로 가장 많았으며, 굴참나무겨우살이의 물 추출물이 100ppm에서 $4.86{\mu}g/ml$로 가장 낮고 매실나무겨우살이가 모든 용매에서 더 많은 폴리페놀을 함유한 것으로 확인되었다. 총 플라보노이드 함량은 굴참나무겨우살이의 80% 에탄올 추출물이 5,000ppm에서 $83.59{\mu}g/ml$로 가장 높았으며, 매실나무겨우살이 물 추출물이 $4.6{\mu}g/ml$로 가장 낮았고 굴참나무겨우살이가 모든 용매에서 더 많은 플라보노이드를 함유한 것으로 확인되었다. DPPH free radical 소거능은 80% 에탄올 추출물 5,000ppm에서 매실나무겨우살이 81.75%로 시료 중 가장 높았고, 굴참나무겨우살이 물 추출물 100ppm이 3.55%로 가장 낮음을 확인할 수 있었다. 본 연구 결과에 따르면, 겨우살이를 초음파추출법으로 추출할 때, 80% 에탄올 초음파추출물이 더 많은 폴리페놀을 함유하여 80% 에탄올 추출물이 물 추출물보다 비교적 적합하였다. 80% 에탄올로 초음파추출 하였을 때 동결건조 한 매실나무겨우살이가 열풍건조한 자연산 굴참나무겨우살이보다 더 많은 폴리페놀을 함유하고 있고, 더 높은 DPPH free radical 소거능을 보여줌에 따라 식 의약품 그리고 화장품의 소재화 및 산업화의 가능성이 높음을 확인할 수 있었다.
한국산 생약재인 가시오갈피 , 마황, 복분자, 인진쑥을 이용하여 추출과정 중 $40^{\circ}C,\;60^{\circ}C,\;100^{\circ}C$로 온도를 달리 하여 기존의 열수 추출방법과 초음파를 범행한 추출로 인해 면역 활성 증진이 다르게 나타나는 효과를 비교 실험하였다. 실험 결과 여러 조건 중 복분자 $60^{\circ}C$, 40 kHz의 초음파 병행 추출물이 가장 좋은 항암활성 증진 효과를 나타내었다. 추출시 모든 열수 추출물들에 비해 초음파 병행 추출물의 추출 수율이 높게 나타났다. 이는 추출시 열수 추출에서 미쳐 빠져나오지 않았던 여러 활성 물질이 초음파 처리에 의해 공동화현상과 더불어 액체간의 상호 탈기 작용에 의해 추출 수율의 상승효과를 가져온 것으로 사료된다. Apoptosis 실험에서는 5일 동안 인간 폐암 세포인 A549의 세포를 이용하여 활성이 좋았던 마황과 복분자의 $60^{\circ}C$ 열수 추출물과 초음파 추출을 병행한 추출물을 이용하여 관찰한 결과 apoptotic이 열수 추출물보다는 초음파 병행 추출물을 투여한 군에서 더 많이 관찰되는 것을 볼 수 있었다. 이와 마찬가지로 HL-60 세포분화능 실험에서도 열수 추출물보다는 초음파를 병행한 추출물들이 높은 세포 분화 활성도를 나타냈다. 또한 모든 조건 중에서 생약재들이 $60^{\circ}C$, 40 kHz 초음파 병행 추출물에서 가장 높은 세포 분화 활성도를 나타냈다. 이러한 결과로 보아, 앞으로 한국산 생약재의 고부가가치 창출을 위해 더 많은 실험을 통하여 초음파의 병행 처리에 따른 효과와 이를 통한 기능성 소재 및 기능성 식품으로의 이용을 위해 더 많은 연구가 이루어져야 할 것으로 생각되어진다.
증류수 및 Ethanol을 용매로 하여 온도 ($60,\;100^{\circ}C$) 및 초음파 병행 조건을 달리한 사자발쑥의 추출에서 초음파를 병행한 $100^{\circ}C$ 열수 추출이 20.51%로 가장 높은 수율을 나타냈다. 또한 $60^{\circ}C$ 및 $100^{\circ}C$ 열수 추출이 $60^{\circ}C$ ethanol 추출에 비해 각각 2배, 3배 정도의 수율 향상을 나타내었으며, 각각의 추출 조건에서 초음파를 병행한 추출이 일반 열수 추출과 비교하여 약 20% 높은 수율을 나타내었다. 인간 정상세포를 이용한 사자발쑥의 세포독성 실험에서 $60^{\circ}C$ ethanol 추출물의 세포독성이 가장 높게 나타났으며 $100^{\circ}C$ 물 추출물의 세포독성이 대체적으로 낮게 나타났다. 또한 초음파를 병행한 추출물이 초음파를 병행하지 않은 각각의 조건에 비해 $5{\sim}8%$ 낮은 세포독성을 나타내었다. 인간 암세포를 이용하여 사자발쑥 추출물의 첨가를 통한 암세포 생육 억제 활성 측정 결과를 통해 0.8 mg/$m{\ell}$ 이상의 농도 조건에서 초음파를 병행한 $100^{\circ}C$ 물 추출물이 최고 73%의 억제 활성을 나타내며 가장 높은 활성을 나타내었고, $60^{\circ}C$ 물 추출물의 초음파 병행 추출물이 농도 의존적으로 $40{\sim}62%$의 활성을 나타냄으로서 모든 농도조건에서 대체적으로 높은 활성을 나타내었다. 또한 각각의 조건에서 초음파를 병행한 추출물의 암세포 억제 활성이 초음파를 병행하지 않은 열수 추출물에 비해 최대 110% 까지 증진된 것을 확인할 수 있었다. 세포선택성에서도 모든 조건에서 초음파를 병행한 추출물이 병행하지 않은 일반 열수 추출물에 비해 증가된 세포선택성을 나타냈다. 암 발생 기작을 알아보기 위한 bcl-2 발현 실험에서 $100^{\circ}C$ 물 추출물의 IOD 수치가 가장 높게 나왔으나 초음파를 병행을 통해 감소하여 가장 적은 수치를 나타냄에 따라 초음파 병행 공정을 통해 열수 추출 공정 및 용매에 따른 암 발생 관련 성분의 발현을 억제할 수 있을 것으로 사료된다. 따라서 사자발쑥의 효율적인 추출을 위해서 $60^{\circ}C$ 이상 $100^{\circ}C$ 미만의 온도에서 물을 용매로 하는 것이 바람직하며, 초음파 병행 공정을 통해 수율 향상 및 세포독성의 저해는 물론 암세포 생육 억제 활성의 증진을 기대할 수 있을 것으로 사료된다.
해조류 유래 유용성분 추출을 위한 초음파 추출법의 적용성을 검토하였다. 동결건조한 감태 분말로부터 열수($65^{\circ}C$), 물($24^{\circ}C$), 50% 에탄올 및 100% 에탄올 뿐만 아니라 초음파 추출을 수행하여, 추출물을 제조하였다. 추출물의 페놀성 화합물 함량, DPPH 라디칼 소거 활성 및 tyrosinase 저해 활성을 분석하고, 초음파 추출과 전통적인 추출법의 차이를 비교하였다. 초음파 추출에 의한 감태 추출물의 페놀성 화합물의 함량(142.80 mg/g)은 열수 추출물의 페놀성 화합물 함량(10.03 mg/g)의 약 14배 이상 높았다. 열수 추출물에 비해 초음파 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성은 약 4배, tyrosinase 저해 활성은 약 14배 이상 높은 것으로 나타났다. 특히 초음파 추출법에 의한 추출물에서의 페놀성 화합물 함량과 DPPH 라디칼 소거활성 및 페놀성 화합물 함량과 tyrosinase 저해 활성간의 상관관계가 매우 높은 것(각각 $R^2$=99.47 및 99.99)으로 나타났다. 이상의 결과는 전통적인 용매 추출법보다 초음파 추출법이 감태의 유용성분 추출에 더 적합함을 의미한다.
마황 (Ephedrae Herba)과 복분자 (Rubus Fructus)의 추출 수율은 $60^{\circ}C$ 초음파 병행 추출물이 $100^{\circ}C$ 물 추출물에 비해 1.6배 이상 높게 추출되었으며, 이는 추출 시 초음파 처리에 의해 액체간의 상호 탈기 작용에 의한 것으로 보이는 작용으로 인하여 기존의 고온 물 추출보다 호율적인 추출이 이루어진 것을 확인할 수 있었다 인간 면역 세포는 마황, 복분자 $60^{\circ}C$ 초음파 병행 추출물이 $1.0g/{\ell}$ 농도에서 각 1.64, 1.68배 이상의 생육을 증진시키는 것이 관찰되었고, 단순 $100^{\circ}C$ 물 추출물 보다 평균 30% 이상의 생육 증진을 확인하였다. 면역 세포의 생육도는 복분자의 $60^{\circ}C$ 초음파 추출물들이 각각 T, B 세포에서 $13{\times}10^4\;cells/m{\ell}$와 $10{\times}10^4\;cells/m{\ell}$을 나타내어 단순 $100^{\circ}C$ 물 추출물의 경우와 비교하여 4일째에 높은 면역 세포의 활성도를 나타내었다. cytokine의 분비 실험에서는 T세포의 IL-6는 복분자 $60^{\circ}C$ 초음파 병행 추출물이 $13.9{\times}10^{-4}$ (pg/cell)로 가장 높은 분비 효과를 나타내었고 물 추출물에 비해 70%의 증진 효과를 확인하였다. $100^{\circ}C$ 열수추출물들보다는 $60^{\circ}C$에서 초음파를 병행한 추출물이 인간 면역세포인 T 세포의 IL-2를 비롯한 유용활성 물질의 분비를 촉진시켜, 물 추출물보다 20% 이상의 활성 증가를 보였다. Macrophage의 $NO^-$ 활성 실험에서 복분자는 물추출물은 $15{\mu}M$와 초음파 추출물은 $22{\mu}M$을 나타내었고, 복분자와 LPS의 혼합처리 시 $23{\mu}M$와 $31{\mu}M$을 나타내어 복분자가 가장 높은 활성을 그리고 초음파 병행 추출에 의한 시료가 가장 높은 활성을 나타내었다. 이러한 결과에 따라 초음파 병행 추출을 통한 생리활성 효과를 확인하였고, 이외의 새로운 공정의 개발을 위한 추출방법을 확립하여 이를 이용한 다양한 기능성 소재 및 기능성 식품의 제조를 위한 연구가 지속되어야 할 것으로 보인다.
참취, 좀개미취, 큰금계국, 기생초 꽃 추출물의 항산화효과를 증가시킬 수 있는 적정 추출방법을 개발하기 위하여 환류냉각추출한 추출물과 15, 30, 45분 동안 초음파 추출한 추출물의 항산화 활성을 비교하였다. 추출수율은 모두 초음파 추출물에서 높게 나타났다. 종에 따라 적정 추출시간은 다르게 나타났으나, 4종 모두 초음파추출물이 환류 냉각추출물 보다 DPPH와 ABTS radical 소거능 및 Ferrousion chelating 활성이 우수하거나 유사하였다. 총 폴리페놀 및 플라보노이드의 함량 또한 대체로 초음파추출물에서 높게 나타났으며, 4종 모두 추출시간이 길어질수록 항산화물질 함량도 증가되는 경향을 보였다. 참취와 큰금계국 꽃 추출물의 지질과산화 억제활성을 비교한 결과, 참취 꽃은 환류냉각추출물, 큰금계국 꽃은 초음파 15분 처리구에서 지질과산화 억제활성이 우수하였다. 연구의 결과, 식물 종 및 목표로 하는 항산화 효과에 따라 추출시간에 차이는 있으나, 초음파추출이 환류냉각추출보다 추출시간이 짧고 항산화 효과를 증가시킬 수 있는 효과적인 추출방법임을 확인할 수 있었다.
당귀, 복분자, 마황의 추출공정 요인별 [추출온도 $(40^{\circ}C,\;60^{\circ}C,\;100^{\circ}C)$, 초음파 병행 (처리조건 : 초음파별) 추출]에 따른 추출물들의 분획물들의 추출수율 증진 및 생산성 향상이 가능한 공정 개발을 위하적 공정 요인에 따라 추출과 분획을 실시하였다. 그 중 모든 분획 추출물 들 중에서 $60^{\circ}C$ 온도에서 40kHz의 초음파 병행 추출한 복분자 water 분획층 수율이 59.63%로 다른 추출 공정에 비하여 가장 높게 나타났으며, 당귀 water 분획층의 수율은 50.17%로 나타나 water 분획층의 수율이 가장 높게 나타났으며, butanol, ethyl acetate, chloroform 분획층의 순서로 수율이 나타난 것을 확인 할 수 있었다. 이것으로 $60^{\circ}C$의 40 kHz 초음파 병행 추출 공정이 생산성이 가장 우수한 것으로 나타났다. 면역활성 증진 효과에서 인간의 면역세포인 B, T 세포에 대한 생육 활성도를 각 공정별 추출물을 이용하여 측정한 결과 $60^{\circ}C$의 40 kHz의 초음파 병행 추출물의 water 분획물에서 180% 이상의 높은 생육 활성도를 나타내었고, butanol 분획물에서는 160% 이상의 높은 생육 활성도를 나타내었다. Cytokines 분비량은 면역 세포에 대한 활성 실험에서 효과가 가장 높게 나타났던 추출공정인 $60^{\circ}C$의 40 kHz 초음파 병행 추출물의 water 분획층과 butanol 분획층을 이용하여 분획물 실험을 행하였다. B세포에서의 IL-6 분비량에 복분자 water 분획충이 1.0 g/l에서 5일째 $17{\times}10^{-4}\;ph/cell$로 가장 높은 증진 효과를 나타내었으며, butanol 분획층이 $16.8{\times}10^{-4}\;pg/cell$의 증진효과를 보였고, 마황과 당귀 water 분획층이 각각 $16.5{\times}10^{-4}\;pg/cell,\;16.5{\times}10^{-4}\;pg/cell$의 증진효과를 보였다 B 세포에서의 $TNF-{\alpha}$분비량은 복분자 water 분획층이 1.0 g/l에서 5일째 $18{\times}10^{-4}\;pg/cell$로 가장 증진 효과가 크게 나타났다. 이것은 세포의 생육이 시간에 따라 증가됨으로서 그에 따른 cytokines의 분비량도 시간에 따라 증가하는 것으로 사료된다. 추출공정 요인인 온도와, 초음파를 달리하여 그것의 분획물인 water 분획층과 butanol 분획층에 대한 T 세포에서의 cytokine 분비량을 측정한 결과 온도의 변화를 준 추출공정에서의 IL-6분비량은 $60^{\circ}C$에서 가장 좋은 분비량을 나타낸 것으로 복분자가 $18.5{\times}10^{-4}\;pg/cell$로 가장 높은 증진 효과를 나타내었다. 마황과 당귀 또한 $60^{\circ}C$로 추출하였을 때, 1.08배, 1.04배 높은 분비량을 나타내었다. 또한 초음파의 주파수의 변화를 주어 추출한 것으로 T세포의 $TNF-{\alpha}$ 분비량을 측정한 결과 40 kHz의 초음파 병행 추출한 복분자 water 분획층이 1.0 g/l 농도에서 $20.4{\times}10^{-4}\;pg/cell$로 60 kHz로 병행 추출한 복분자 water 분획층의 $19.5{\times}10^{-4}\;pg/cell$보다 높은 분비량을 나타내었다. 당귀와 마황에서도 40 kHz의 초음파로 병행 추출한 것이 더 높은 분비량을 나타내었다. NK-cell의 활성도를 공정 요인별로 측정한 결과 가장 좋은 활성도를 나타낸 것으로는 $60^{\circ}C$에서 40 kHz의 초음파로 병행 추출한 복분자 water 분획층 이 배양 6일째 날 1.0 g/l의 농도에서 97%, butanol 분획층은 93%의 활성증진을 보여 초음파 병행 추출하지 많은 것과 다른 온도 조건에 비해 높은 생육 활성도를 나타내었다. 그리고 당귀 분획물 또한 $60^{\circ}C$, 40 kHz의 초음파 추출물의 water 분획층과 butanol 분획층에서 각 92%와 80%의 활성 증진을 나타내 다른 추출 공정보다 높은 활성을 나타내었다. 이것으로 알 수 있듯이 생체 방어 기능을 증진 시킬 수 있는 최적의 추출공정으로는 $60^{\circ}C$에서 40 kHz의 초음파를 병행하여 추출하는 것으로 사료된다. 세포 분화활성도의 측정 결과는 복분자 water분획층이 가장 높은 세포 분화 활성도를 나타내었고, 또한 복분자와 마황의 분획물이 crude 상태의 초음파 병행 추출물에 비해 최고 20% 이상의 분화 활성도를 나타내는 것을 확인 할 수 있었다.
본 연구에서는 인천광역시 강화군의 특화작물을 이용한 기능성 소재를 개발하기 위해 순무 캘러스를 배양하고 열수, 초음파 그리고 에탄올 추출하여 생리활성을 평가하였다. 순무 캘러스의 열수, 초음파 그리고 에탄올 추출물에서 DPPH radical소거활성이 대조군에 비해 농도 의존적으로 증가하였다. 순무 캘러스 에탄올 추출물의 수렴효과는 열수 및 초음파 추출물보다 높게 나타났다. 콜라겐 생합성량을 측정한 결과 순무 캘러스 에탄올 추출물의 5 ppm과 10 ppm 농도에서 59%와 78%의 주름개선 효과를 확인하였다. 이러한 결과들은 순무 캘러스의 열수, 초음파 그리고 에탄올 추출물이 천연 항산화 소재로의 활용이 가능할 것으로 사료되며 특히, 에탄올 추출물은 수렴효과와 주름개선 효과가 뛰어나 기능성 화장품 천연소재로서의 활용이 가능할 것으로 기대된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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제 6 장 손해배상 및 기타사항
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[부 칙]
1. (시행일) 이 약관은 2016년 9월 5일부터 적용되며, 종전 약관은 본 약관으로 대체되며, 개정된 약관의 적용일 이전 가입자도 개정된 약관의 적용을 받습니다.