장메주의 Protease activity는 54시간 발효시(醱酵時)에 가장 높았고 (Fig. 1) 유리아미노태질소(態窒素)는 $36{\sim}42$시간에서 가장 많이 유리되었으며 총산(總酸)은 24시간에서 제일 많았다. 수분(水分)이 많은 청국장은 적은 것에 비(比)하여 아미노태질소(態窒素)의 유리양이 많았고 그후에는 감소(減少)되었으나 5일까지는 거의 같게 증가되어 peak를 이루었다. 청국장의 총산(總酸)은 20일까지 계속 증가했고 그후에는 서서히 증감(增減)했으며 수분(水分)이 많은 것이 작은 것보다 총산(總酸)이 현저히 많았다.(Table 2) 숙성도(熟成度)와 총산량(總酸量)으로 보아 청국장의 수분함량(水分含量)은 55%가 좋았다.
Alcalase, protamex 및 neutrase 효소처리가 청국장의 펩타이드 및 항산화 활성 증가에 미치는 영향을 동일한 조건으로 효소 처리한 대두분말과 비교하였다. 효소 20, 100 및 500 mAU를 $50^{\circ}C$에서 120분간 처리한 결과 청국장과 대두분말 모두에서 alcalase 및 protamex에 의한 펩타이드 생성이 neutrase보다 높게 나타났다. 항산화 활성은 청국장의 경우 alcalase 처리에 의해 DPPH, ABTS 및 hydroxyl radical 소거활성이 효소처리를 하지 않은 대조구와 비교하여 시료량에 따라 각각 37~57%, 59~106% 및 67~83%, protamex 처리에 의해 35~50%, 56~74% 및 52~75% 통계적으로 유의하게 증가하였다. 대두분말을 효소 처리한 시료에서도 유사한 결과를 보여 alcalase 처리에 의해 DPPH, ABTS 및 hydroxyl radical 소거활성이 각각 37~55%, 51~99% 및 67~83%, protamex 처리에 의해 36~44%, 44~66% 및 51~65% 증가하였다. 그러나 두 시료 모두에서 neutrase 처리에 의한 항산화 활성의 유의적 증가는 없었다. 이상의 결과는 alcalase와 protamex가 청국장에 특이적이지는 않으나 펩타이드 생성 및 항산화 활성 증가에 효율적임을 보여주고 있다.
Bacillus licheniformis Bl을 이용하여 청국장발효를 거쳐 보존성이 높은 분말청국장을 제조하였다. 분말청국장의 다양한 생리활성 물질 중에서도 항산화물질의 존재여부와 그 효괴를 결정하였다. 분말청국장을 증류수로 추출하여, Sephadex G-75 Bel filtration chromatography 작업을 수행한 후, 390 nm에서 광범위한 분자량의 갈변물질을 검출 할 수 있었다. 1,1 diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)를 이용하여 갈변물질의 항산화도를 결정하였다. 분자량이 큰 갈변물질의 항산화도는 매우 약하였으나, 분자량이 작은 갈변물질에서는 10-20%의 항산화능이 결정되었다. 체내에서는 분자량이 작은 갈변물질의 흡수가 더 유리할 수 있다. 분말청국장의 항산화물질 추출에 ethanol을 이용했을때는 60.1%, methanol을 이용했을 때는 58.97%의 높은 항산화능을 보여주어, 증류수로 추출했을 때에 비해 휠씬 효 율적이었다. 또한 분말컹국장을 ethanol 5%이상 되게끔 녹였을 때 항산화도가 가장 컸다. 본 분말청국장에 존재하는 항산화물질은 항산화능이 우수하였는 데, 앞으로 안정성이 확보된다면, 식용류, 주류에 첨가하는 천연 항산화물질로 개발할 수 있을 것이다.
대두발효식품인 청국장에는 다양한 항산화물질, peptide 등의 생리활성물질이 존재한다. 청국장 ethanol 추출물은 285 nm에서 0.55의 흡광도 값을 보여 주었다. 이 영역에는 phenol을 포함한 아미노산 및 peptide류가 포함되어 있다고 알려져 있다. 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)방법으로 청국장의 항산화도를 측정했을 때, ethanol 추출물의 농도가 증가할수록 항산화도는 증가하였다. 무염 생청국장 30 g을 복용하고 2시간 마다 혈압을 측정하였다. 수축기혈압은 복용 후 6시간 지난 후, 평균혈압이 14 mmHg 떨어졌고, 이완기혈압은 8 mmHg 떨어지는 등 혈압강하 효과가 뚜렷하였다. 청국장에 존재하는 daidzein, 항산화물질, Lys-Pro과 같은 angiotensin I-converting enzyme (ACE) 억제제 등이 복합적으로 작용하면서 혈압강하에 기여할 수 있을 것이다.
대두가 발효된 청국장에는 미생물, 다양한 효소와 생리활성물질이 존재한다. 청국장의 탄수화물을 분해하는 cellulase에 대한 연구는 많지 않다. Oligosaccharide는다양한 생리활성을 지니고 있다. Congo red test 및 활성염색을 통해, 효소액이 cellulase를 포함하는 것을 확인했다. 청국장 발효 균주 Bacillus licheniformis B1이 분비하는 cellulase활성의 최적 pH와 온도는 각각 10과 $40^{\circ}C$이었다. TLC분석을 통해 효소액은 carboxymethyl cellulose (CMC)를 분해하여 2탄당 이상을 생성함을 확인하였다. 본 균주를 이용해서 제조한 보리 청국장에서는 효소의 활성이 증가되었다. 본 균주의 cellulase 유전자를 클로닝하여 분석한 결과, 본 효소는 ${\beta}$-1,4-glucanase였으며, 전체 coding 영역 $10{\sim}460$번째 아미노산 영역 중, 32군데서 polymorphism을 보였다.
Bacillus sp. CS-17를 이용하여 청국장을 제조한 후 발효기간별 특성을 조사하였다. pH는 발효가 진행됨에 따라 점차 알카리화하였다. 색도를 조사한 결과 명도는 숙성이 지속될수록 낮아졌으며, 황색도는 약간 증가 하였다. 적색도는 차이가 없었다. 지용성 갈변물질은 거의 생성되지 않았으며, 수용성 갈현물질은 많은 양이 생성되었다. 강도와 경도는 발효초기부터 급격히 감소하였다. 아미노산 총 함량은 $8274.7{\sim}9301.4\;mg%$이었고 phenylalanine, lysine, leucine, tyrosine이 많이 함유되어 있었다. 총 필수아미노산의 함량은 총 아미노산에 대해 $66.6{\sim}71.8%$였다. 관능검사를 실시한 결과 향기를 제외한 모든 영역에서 숙성이 지속되어도 그 기호도가 감소하지 않았으며, 시판청국장과도 차이가 없었다.
본 연구에서는 콩에서 유래한 단기 발효식품인 청국장, 물두시, 낫또 제품 중 대표적인 제품을 각각 하나씩 선택하여 이들의 일반적 특성과 항돌연변이 효능 및 항암 효능을 비교 연구하였다. 청국장은 아미노태 질소 및 암모니아태 질소의 함량이 높았으나, 낫또는 그 함량이 낮게 나타났다. 물두시의 경우 여타 발효식품에 비해 pH가 낮고 산도가 높았다. Ames test 및 HT-29 인체 대장암세포를 이용한 실험에서는 청국장이 우월한 항돌연변이 및 항암 효능을 나타냈다. 이상의 결과로 볼 때 청국장은 전반적으로 기능성이 우수한 것으로 나타났으며, 물두시는 낫또에 비해 기능성이 더 나은 것으로 나타났다. 이는 발효 기간의 차이, 제조방식, 원재료의 품질 등에 의한 것으로 여겨지며, 향후 각국의 식문화 및 조리 방식 등의 차이에 기초를 둔 추가적인 연구가 필요할 것으로 여겨진다.
본 연구에서는 혈전용해능이 우수한 균주를 선별하여 청국장의 발효 특성을 비교 조사하였다. 시판청국장에서 분리된 5종 균주의 혈전용해능을 비교한 결과, N2가 $41.7\%$(Plasmin lunit/mL과 비교)로 가장 높게 나타났고 N3, N5가 각각 $27.8\%$를 나타내었다. N2 균주의 kit동정 결과, B. subtilis와 $90.1\%$ 유사한 균주로 나타났다. 이를 활용하여 청국장을 제조한 결과, 분양균주에서는 B. subtilis (KCTC 3014)가 가장 많은 점질물을 생성하였고, 혈전용해능과 아미노태질소 함량도 가장 높은 것으로 나타났다. 그리고 분리균주에서는 B. subtilis N2가 점질물 함량, 혈전용해능, 아미노태질소 함량이 가장 높은 것으로 나타났다. 증자시간에 따른 영향을 조사한 결과 B. subtilis (KCTC 3014)와 B. subtilis N2를 접종한 청국장은 증자시간을 45분이 적합한 것으로 나타났으며, 발효시 간은 20시간정도가 적합한 것으로 나타났다.
보리, 쑥, 다시마, 대두를 재료로 하고 Bacillus licheniformis Bl을 접종하여, 맛과 향이 향상된 청국장을 제조하였다. 본 혼합발효에서 단백질분해효소의 활성은 발효시작 하루만에 최대치에 이르렀으며, 발효시작 2일만에 pH는 8.4까지 증가하였다. 당과 아미노산에 의해 생성되는 갈변물질은 초기에 비해 20배 이상 증가하였다. 이상으로 대두에 보리, 쑥, 다시마를 혼합하여도 청국장 제조가 가능함을 확인할 수 있었다. Ethanol과 methanol에 녹인 혼합 발효분말의 농도를 각각 0.2에서 1%(w/v)로 증가시킬수록 농도의존적으로 항산화도는 증가하였다. 항산화도는 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)를 이용하여 결정하였다. Methanol에 1%의 분말청국장을 녹였을 때 항산화도가 가장 높았다. 고혈압군이 본 혼합 발효분말 20 g을 복용했을 때 수축기 혈압이 2시간 지나 10 mmHg 떨어지는 강하효과가 있었다. 또한 맛과 향의 선호도면에서 보리, 쑥, 다시마가 포함된 혼합 발효분말이 발효대두보다 t검정으로 유의적으로 높음을 보였다. 혼합 발효분말은 앞으로 혈압강하용 기능성 청국장으로 개발될 수 있을 것이다.
발효대두 청국장에는 대두단백질이 발효에 의해 분해 형성된 다양한 펩타이드류가 들어 있다. 청국장 추출물이 처리된 유방암세포의 microarray data와 잘 알려진 유방암 전이 마커를 합쳐서 새로운 연결망이 제조되었으며 이를 이용해 전이 마커와 발현 차이가 있는 단백질 사이의 상호작용을 체크하였다. 연결망 분석을 통해 PLAU (plasminogen activator, urokinase, uPA)와 ERBB2 (epidermal growth factor receptor 2)를 실제 전이 가능성을 보여주는 유전자로 선택하였다. MCF7 암세포를 청국장추출물로 처리하고 PLAU와 ERBB2 발현정도를 측정하였다. 청국장 추출물은 PLAU와 ERBB2 발현을 상당히 억제하였다. 청국장 추출물을 처리한 암세포에서 염증 마커인 NO의 생산이 감소하였다. 인간 유방암세포에서 PLAU와 ERBB2 발현을 특이적으로 감소시키는 펩타이드를 찾아내는 것은 흥미로운 일일 것이다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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