백김치를 담근 후 15$^{\circ}C$에서 60일간 밀폐상태로 발효시키면서 발효일수 경과에 따른 pH, 총산함량 및 미생물수의 변화를 조사하고, 주요 미생물군집을 분리.동정하였다. 담금 즉시의 김치는 pH 6.15, 총산 0.03%였고, Gram 음성 간균류가 치우점 미생물이었으며 이들의 주요 속 구성은 Pseudomonas 55%, Enterobacter 40%, Erwinia 5%였다. 젖산균은 발효 2일 이후부터 최우점 미생물이 되었으며, 발효 4일, 12일 및 50일에 젖산균의 1차, 2차 및 3차 정상기를 각각 나타내었다. 젖산균 2차 정상기의 김치는 pH 3.51, 총산 0.59%로 적숙상태에 해당되며, 이 때 주요 젖산균의 종 구성은 Lactobacillus bavaricus 55%, Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides 42.5%, Leuconostoc paramesenteroides 2.5%였다. 젖산균 3차 정상기의 김치는 pH 3.40, 총산 1.10%로 과숙상태에 해당되며, 이 때 주요 젖산균의 종 구성은 Lactobacillus plantarum 65%, Lactobacillus brevis 35%였다. 젖산균들을 동정할 때에 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides, Leuconostoc paramesenteroides, Lactobacillus plantarum 및 Lactobacillus brevis로 동정된 균주들은 기존의 분류체제에 비교적 잘 일치하였으나, Lactobacillus bavaricus로 동정된 균주들은 일치하지 않는 점들을 많이 나타내었다. 젖산균의 수가 증가할 때에 효모의 수가 감소하였고, 젖산균의 수가 감소할 때에 효모의 수가 증가하였다. 효모의 정상기는 젖산균이 제2정상기와 제3정상기의 사이인 30일에 나타났으며, 이 때 주요 효모의 속은 모두 Saccharomyces였다.
돼지고기에서 분리한 bacteriocin 생성능이 우수한 젖산균을 동정하기 위하여 이미 알려진 몇가지 젖산균을 참고균으로 하여 10% denaturing polyacrylamide gel에 전기영동으로 전개한 5S rRNA 와 tRNA 등 150개 이하의 핵산으로 구성된 저분자량 RNA(Low Molecular Weight RNA : LMW RNA) profiles에 나타난 15~25개의 밴드 양상이 균에 따라 차이점을 보여 동정에 효과적으로 이용할 수 있었다. 새로 분리한 젖산균은 참고균과는 다른 균종이었다. APT, TSB, MRS의 3종류 다른 배지에서 배양하여도 LMW RNA profiles에는 차이가 없었으며, 겔상의 밴드 전개거리를 3개의 표준 분자량 물질을 이용하여 만든 표준곡선을 사용하여 상대핵산단위(relative nucleotide units : RNU)로 나타낸 밴드의 양상을 도표화 하는 것이 profiles를 서로 비교 하는데 편리하였다.
본 연구에서는 시판 김치로부터 분리된 젖산균을 동정하였다. 제조 후 4일 동안 실온에서 배양된 배추김치에서 12주, 2일 동안 실온에서 배양한 총각김치에서 6주, 5일 동안 실온에서 배양한 깍두기에서 15주, 그리고 4일 동안 배양한 파김치에서 23주의 젖산균이 분리되었다. 배추김치에서 분리된 12주의 젖산균 중 8주는 Lactobacillus plantarum로, 1주는 Leuconostoc lactis로, 2주는 Lactobacillus casei subsp. pseudoplantarum으로, 그리고 1주는 Lactobacillus sake로 동정되었다. 총각김치에서 분리된 6주의 젖산균 중 3주는 Leuconostoc paramesenteroides로, 2주는 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides로, 그리고 1주는 Lactobacillus plantarum로 동정되었다. 깍두기에서 분리된 15주 중 2주는 Leuconostoc lactis로, 3주는 Leuconostoc mesenteroides subsp. dextricum로, 4주는 Lactobacillus casei subsp. pseudoplantarum로, 그리고 4주는 Lactobacillus coryniformis subsp. torquens로 동정되었다. 파김치에서 분리된 23주 중 22주는 L. plantarum으로 그리고 1주는 Lactobacillus sake로 동정되었다. 이상의 결과로부터, 배추김치에서는 L. plantarum이, 총각김치에서는 L. paramesenteroides이, 깍두기에서는 L. casei subsp. pseudoplantarum과 L. coryniformis subsp. torquens이, 그리고 파김치에서는 L. plantarum이 가장 많이 동정되었다. 특히 파김치에서는 선발된 23주 중 1주를 제외하고는 모두 L. plantarum으로 동정되었다.
본 연구는 sourdough 제빵에 관여하는 우수한 효모와 젖산균을 분리, 선별하고 이들의 최적 배지 조성을 연구하였다. 1차 분리된 젖산균 115균주 중 항균성이 우수하고, 산 생성 및 향이 우수한 균주를 선별하여 동정한 결과 Leuconostoc sp.로 나타났다. 효모는 8개 균주를 1차 선별하였으며, 발효와 향이 우수한 균주를 선별하여 동정한 결과 Saccharomyces sp.로 동정되었다. 당 발효성을 실험한 결과, glucose와 sucrose에서 생육이 우수하였으나, 상업적으로 많이 사용하고 있는 sucrose가 좋을 것으로 판단되었다. 젖산균은 밀가루배지에 1% sucrose첨가만으로 생육이 우수하였으나, 효모인 경우는 증식이 더 필요하였다. 추가적으로 분리된 효모의 생육 실험을 하여 나타난 최적배지조성은 wheat flour 0.5%, peptone 0.5%, sucrose 3%로 나타났으며, 젖산균인 경우는 peptone의 첨가없이 wheat flour 0.5%, sucrose 1%로 나타났다.
건강한 성인의 분변으로부터 담즙산 분해능이 우수한 젖산균의 분리를 위하여 무작위 선별법과 도말법을 사용하여 층 120주의 젖산균을 1차 분리하였고, 그중 5종의 젖산균을 최종 선발하였다. 유용한 젖산균이 갖추어야할 중요한 성질인 내산성, 내담즙산성, 대장균 저해능을 시험한 결과 Lactobacillus sp. CK 102이 가장 우수한 균주로 나타났다. Lactobacillus sp. CK 102 균주는 pH 2.0에서 68% 이상의 내성과 1.0% 담즙산이 함유된 배지에서 90%이상의 내성을 나타냈으며 MRS 배지에서 대장균과 혼합 배양시 18시간 이내에 대장균을 100% 사멸시켰다. 젖산균제로써 기능이 가장 우수한 균주인 Lactobacillus sp. CK 102를 API kit와 16S rRNA sequencing 방법을 사용하여 동정한 결과 Lactobacillus platarum 으로 밝혀졌다. 이상의 결과에서 분리한 Lactobacillus sp. CK 102는 생균제로서 안전하게 이용할 수 있는 것으로 나타났다.
김치의 발효온도를 5, 20 및 $30^{\circ}C$로 달리하여 발효기간 중의 젖산균의 경시적인 변화를 선택배지를 이용하여 젖산균군별로 계수하는 방법으로 비교하고 이들 젖산균을 분리하여 형태적, 배양적 및 생리적 특징에 따라 동정하였다. Leuconostoc, Lactobacillus, Streptococcus 및 Pediococcus속의 각 젖산균의 경지적인 변화는 각 온도에 있어서 그 양상이 비슷하고 온도가 높을수록 빨리 진행되었다. 이들 중 Leuconostoc 및 Lactobacillus가 높은 분포를 나타내었으며 낮은 온도에서는 Leuconostoc는 증가하고 기타의 젖산균은 감소하는 경향이 있었다.
한국인의 주된 위 건강의 저해인자인 Helicobacter pylori를 저해하는 젖산균을 타락과 김치에서 분리하여 특성을 분석하고자 하였다. 전통발효 젖산균음료인 타락 5개와 김치 30종을 안동 지역과 수도권의 시장에서 구입하고, 젖산균을 전통적인 분리방법에 따라 15주를 분리하였다. 이들 젖산균에 대하여 H. pylori 생육 저해 활성이 높은 두 개의 젖산균을 선택하여 동정하였다. 이들 젖산균은 전형적인 생화학적인 특성과 16S DNA의 분석을 통하여 타락에서 분리된 균은 Streptococcus thermophilus LAB kw15로 김치에서 분리된 균은 Leuconostoc mesenteroides LAB kw5로 동정하였다. 이들 분리 균주 배양액을 중성으로 조정한 후 첨가하여 배양할 때 H. pylori의 생육을 현저히 저해하였으며, H. pylori와의 혼합 배양에서도 H. pylori의 생육을 저해하는 것으로 나타났다. 그러므로 이 분리 젖산균의 대사산물이 H. pylori의 생육을 저해하고 있는 것으로 나타나, 기능성 젖산균으로의 활용이 가능할 것으로 판단된다.
김치 젖산균인 WL6는 API kit 또는 Biolog system방법에 의하여 동정한 결과, Leuconostoc mesenteroides ssp. cremoris, Leu. mesenteroides ssp. dextranicum 또는 Lactobacillus bifermentans로 나타나 동정되지 않았다. 그러나, pepN gene과 16S rRNA gene으로부터 2개의 specific-sequence primer set을 제조하여 PCR 방법으로 증폭한 후에 표준균주들과 비교한 결과, WL6는 Lactobacillus bifermentans로 추정되었다.
전국 각지에서 수집한 누룩 27개 시료에 대해서 젖산균수 및 총균수를 조사하고 젖산균을 분리, 동정하였다. 젖산균수 및 총균수의 평균치는 각각 $2.12{\times}10^7$ cfu 및 $2.08{\times}10^8\;cfu/g$이었으며 시료에 따라 젖산균수는 큰 차이가 없으나 총균수에 있어서는 큰 차이를 나타내었다. 젖산균 중 구균이 $70{\sim}95%$를 차지하였으며 분리된 32균주는 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides (11균주), Pediococcus (7균주), Lactobacillus plantarum (3균주), L. murinus (7균주) 및 Enterococcus (4균주)로 동정하였다(1995년 1월 19일 접수, 1995년 2월 16일 수리).
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[게시일 2004년 10월 1일]
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