• 생명과학회지
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• 제30권3호
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• pp.304-312
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• 2020

한천분해효소(agarase)는 기초과학영역, 한천유래 고기능성 올리고당의 생산, 해조류를 이용한 바이오에너지 생산 등에 사용될 수 있다. 본 연구진은 2012년에 한천의 분류, 기원, 생산 및 응용에 관하여 총설하였다. 이에 본고에서는 2012년부터의 agarase 재조합 발현에 대해 총설하고자 한다. Agarase의 재조합 발현에 사용된 유전자는 Agarivorans 속(genus) 세균, Flameovirga 속 세균, Pseudoalteromonas 속 세균, Gayadomonas 속 세균, Catenovulum 속 세균, Microbulbifer 속 세균, Cellulophaga속 세균, Saccharophagus 속 세균, Simiduia 속, Vibrio 속 세균 등의 19종의 세균들에서 유래하였다. 47개의 재조합 발현된 agarase 중에서 α-agarase는 2개였고 나머지는 모두 β-agarase 였다. α-Agarase는 모두 agarotetraose (A4)를 생산하였고 β-agarase는 NA2부터 NA12까지 다양한 산물을 생산하였다. 최적온도는 25~60℃, 최적 pH는 3.0~8.5의 범위였다. 50℃ 이상의 최적 온도를 갖는 agarase는 14개로 이들은 한천을 가열한 후에 졸상태가 유지되는 온도에서도 활발한 활성을 보일 것이다. CBM (carbohydrate-binding module)의 조작 등의 인위적 돌연변이로 agarase의 열안정성 증가, 최적온도와 활성의 동시 증가에 관한 연구 사례도 있었다. 재조합발현의 숙주로 E. coli, B. subtilis, S. lividans, S. cerevisiae 등이 활용되었으며, agarase 유전자의 분비신호, 다른 생물의 분비신호 및 riboswitch가 agarase의 재조합 발현에 사용되었다. Agarase를 정제한 후에 아미노산 서열에 기반한 유전자 재조합 이외에도 게놈서열 파악과 유사성 비교를 통해 putative agarase와 메타게놈에서 유래한 agarase의 재조합 발현에 관한 연구도 있다. 이러한 연구들은 향후 agarase 및 agarase를 이용한 한천분해산물의 응용 분야 등에 활발하게 이용될 것으로 기대된다.

• 미생물과산업
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• 제16권3호
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• pp.44-47
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• 1990

Avery, MacLeod, McCarty가 1944년에 세균에서 유전적 재조합이 이루어진다는 사실을 발견한 후 세균은 진화 학자들과 미생물 학자들로 부터 주목을 받기 시작했다. 왜냐하면 세균은 자연생태계에서 또다른 형태의 유전적 적응성을 지니고 그러한 돌영변이 중 일부는 모세포(parent cell)보다도 주변환경에 더 잘 적응되었기 때문이다. 이제까지 GEM들이 생태계에서 유전자들 전이시키는 빈도가 대부분 낮았고, 토양이나 다른 자연생태계애서 유전자의 전이가 지속적으로 일어난다는 실험적 증거는 없었지만 이들을 생태계에 방출한 결과 유전자 전이가 몇몇 실험에서 확인된 적이 있어 토양에서의 유전적 전이의 가능성을 강하게 암시하고 있다. 하지만 어떻게 전이되고 토양의 물리, 화학및 전이에 필요한 최소한의 donor와 recipient의 수와 정확한 감지 방법등이 아직까지 밝혀져 있지 않은 상태이다. 더우기 토양환경에서 미생물의 활성과 생태, 군집 동태에 영향을 줄 수 있는 기능을 나타내려면 얼마만큼의 재조합 세균이 단위면적당 필요한지도 밝혀지지 않은 상태이다. 따라서 이러한 여러가지 문제점을 밝히는 것은 학문적인면 뿐만 아니라 진화론적인 이론에도 도움이 되며 GEM들이 토양이나 다른 생태계에 유출되었을 때의 환경영향평가나 규제를 하는데에도 도움이 될 수 있다고 본다.

• 대한환경공학회지
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• 제27권8호
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• pp.900-906
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• 2005

수계에 존재하는 중금속의 급성독성을 평가하기 위해 발광유전자를 대장균에 삽입한 재조합 대장균($DH5{\alpha}$/pSB311)과 해양성 발광세균인 Vibrio fisheri를 바이오센서로 사용하는 LumisTox를 비교 평가하였다. 재조합 발광대장균인 $DH5{\alpha}$/pSB311는 Photorhabdus luminescens로부터 발광유전자인 lux CDABE를 분리하여 multicopy plasmid pACYC184에 재조합한 것이다. $DH5{\alpha}$/pSB311는 기존의 재조합 발광세균과 달리 발광반응 시 별도의 기질이 소모되지 않는 특성이 있다. 중금속의 급성독성을 평가한 결과 수은과 구리가 아연과 카드뮴에 비해 상대적으로 강한 독성을 나타났고 $DH5{\alpha}$/pSB311의 중금속에 대한 민감도는 Vibrio fisheri를 이용한 LumisTox에 비해 같거나 민감한 반응을 나타냈다. 측정된 중금속 급성독성의 강도는 $DH5{\alpha}$/pSB311의 경우 $Hg^{2+}>Cu^{2+}>Zn^{2+}>Cd^{2+}$의 순이고 LumisTox는 $Hg^{2+}>Cu^{2+}>Cd^{2+}>Zn^{2+}$ 순으로 나타났다. 재조합 발광세균을 이용한 바이오센서는 검출민감도, 신속한 측정 및 조작의 간편성을 충족시킬 수 있는 기술이며 또한 재조합 기술의 진보에 따라 계속적으로 기능이 향상될 수 있다는 특징이 있다.

• 한국어류학회지
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• 제19권2호
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• pp.83-87
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• 2007

어류 에드워드감염증에 대한 예방 재조합 ghost 백신을 개발하기 위한 연구의 일환으로 어류 병원성 세균인 Edwardsiella trada를 대상으로 플라스미드 형질전환을 실시하고 형질전환 안정성을 평가하였으며, 형질 도입된 재조합 ghost 세균의 E-lysis 유전자 발현을 분석하였다. E. tarda를 대상으로 한 ghost 유도는 대장균에 비해 상대적으로 장시간의 반응 시간이 요구되며 lysis의 개시가 지연된 점을 고려 시 발현된 E protein의 용해 능력 또는 E-gene의 전사발현 양이 E. tarda에서 다소 약화되는 것으로 나타났다. 그러나 대장균에 비해 ghost 유도 속도가 다소 낮음에도 불구하고 반응이 완성되었을 시점에서의 E. tarda의 ghost 효율은 대장균과 전혀 차이가 없이 99.99% 이상의 유도효율을 나타내었다.

• 생명과학회지
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• 제17권11호
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• pp.1601-1604
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• 2007

Agarivorans sp. JA-1 유래의 내열성 ${\beta}-agarase$ 유전자의 분비형 과발현과 재조합효소분해산물의 항균효과를 확인하였다. B. subtilis 168, DB104, ISW1214의 3가지 재조합발현 숙주를 비교하여 ISW1214 균주가 LB배지에서 배양 9시간에 총 효소활성 52,460 U과 비활성 201 U/mg의 최대 발현량을 보이는 것을 확인하였다. 이는 E. coli BL21 균주에 비해 총 효소활성은 약 90배, 비활성은 약 100배 증가한 결과이다. 재조합 ${\beta}-agarase$의 기질로 저가의 한천을 사용하여 neoagarobiose, neoagarotetraose 등 의 neoagarooligosaccharide를 생산하였으며, 생산된 neoagarooligosaccharides는 그람양성 세균인 B. subtilis와 그람음성 세균인 E. coli 모두의 성장을 저해하는 항균활성이 있음을 확인하였다. 따라서 본 연구에서 생산된 재조합 ${\beta}-agarase$와 재조합 효소의 한천분해 산물은 식품산업 등에 사용가능한 천연 항균제 생산에 활용이 가능할 것으로 기대된다.

• 생명과학회지
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• 제20권12호
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• pp.1743-1749
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• 2010

Edwardsiella tarda는 그람 음성의 장내세균과의 주요 어병세균으로 어류에 edwardsiellosis를 유발하는 전신감염성 병원체이다. 최근 병원성 세균의 외막 단백질들은 세균성 감염에 있어서 숙주와 반응하여 면역반응을 유도하는 것으로 여겨져 연구가 되고 있다. 일본의 연구팀은 어류에서 에드워드병의 원인체인 E. tarda의 37 kDa 단백질이 넙치에서 높은 항원성을 제시하는 것을 보고하였다. 또한 그 연구자들은 37 kDa 단백질의 N-말단 아미노산 서열이 GAPDH와 대응하는 것을 밝혔다. 본 연구에서는 다른 세균에서 알려진 N-말단 서열을 기반으로 primer를 제작하여 이에 상응하는 E. tarda DNA를 증폭하고 클로닝하였다. 이 DNA단편의 염기서열은 예상한 바와 같이 세균의 GAPDH유전자인 gapA와 높은 상동성이 있고, E. tarda GAPDH (etGAPDH)의 아미노산 서열은 다른 장내세균의 GAPDH와 70% 이상의 상동성을 보이는 것을 확인하였다. E. tarda의 외막단백질에 특이적으로 반응하는 항체를 이용하여 E. tarda의 GAPDH가 외막에 존재한다는 것을 증명하였고, gapA의 염기서열을 바탕으로하여 재조합 GAPDH를 과발현 시켰다. 과발현된 재조합단백질 GAPDH는 GAPDH 특이적인 항체를 제조하는데 사용되었고, 또한 넙치에 면역시켜 단일 단백질 백신으로서의 활용도를 모색하였다. 비록 재조합 GAPDH가 면역된 넙치에서 GAPDH에 특이적인 항체가 증가하였음에도 불구하고, E. tarda로 공격실험을 하였을 때 면역된 넙치의 생존율이 12.5%로 측정되어 면역된 그룹과 면역되지 않은 그룹간에 큰 차이가 없는 것이 확인되었다.

• 한국응용곤충학회지
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• 제55권2호
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• pp.81-89
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• 2016

이중가닥 RNA (double-stranded RNA, dsRNA)는 표적 유전자의 발현을 억제하는 기능으로 해충방제에 응용되었다. 인테그린은 ${\alpha}$와 ${\beta}$ 단위체로 구성된 이량체 막 단백질이다. 진핵생명체에서 인테그린은 세포-세포 및 세포-세포외기질의 상호연결에 중요한 역할을 담당한다. 인테그린 ${\beta}$ 단위체 발현을 억제하는 특정한 dsRNA (= dsINT)는 해당 곤충에 뚜렷한 치사효과를 유발한다. 또한, dsINT를 발현시키는 형질전환된 대장균도 해당 곤충에 뚜렷한 살충력을 가진다. 그러나 이 세균 살충제의 야외 적용을 위해서는 제형화 기술이 필요했다. 본 연구는 dsINT를 발현하는 재조합 세균을 동결 건조시켜 대상 곤충에 대해 살충효능을 검정하였다. 동결 건조된 세균은 파밤나방(Spodoptera exigua) 종령 유충에 높은 섭식독을 일으켰다. 파밤나방에 대해서 Bacillus thuringiensis 상용 살충제 처리는 불과 60%의 살충력을 보이는 반면, 동결 건조된 dsINT 발현 세균과 혼합 처리할 때 살충력은 크게 증가하였다. dsINT 발현 세균은 해당 인테그린 염기서열 유사성에 따라 차이를 보이는 해충 종에 선택적 독성을 나타냈다. 이 결과는 인테그린에 특이적 dsRNA를 발현하는 세균이 동결 건조 제형화 조건하에서도 살충력을 유지한다는 것을 나타냈다.

• 생명과학회지
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• 제22권8호
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• pp.1024-1033
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• 2012

Kocuria gwangalliensis로부터 카로티노이드 생합성 경로의 첫 번째 단계 기질인 geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP)를 생합성하는 GGPP synthase (CrtE)를 암호화하고 있는 crtE를 클로닝 하여 이를 KgGGPP로 명명하였다. 기존 세균에서 밝혀진 GGPP synthase의 아미노산 서열을 NCBI에서 검색하여 KgGGPP synthase의 아미노산 서열과 비교한 결과 Kocuria rhizophila와 59.6%의 상동성을 가지는 것을 확인하였다. crtE 유전자를 대장균에서 발현 시키기 위하여 pCcrtE 재조합 DNA를 구축하였고, 이를 대장균에서 발현시킨 결과 약 41 kDa의 재조합 단백질이 과발현 됨을 확인 할 수 있었으며, 이 단백질은 기존 세균에서 밝혀진 GGPP synthase와 유사한 분자량을 가지고 있다는 것을 알 수 있었다. CrtE 재조합 단백질의 활성을 분석하기 위하여 대장균 내에서 라이코펜의 생합성을 유도 하였다. 대장균의 경우 메발론산 경로를 통하여 FPP와 IPP를 생합성 하지만 crtE, crtB, crtI 유전자가 없기 때문에 라이코펜을 생합성 하지는 못한다. 대장균 내에서 라이코펜의 생합성을 위해서는 crtE, crtB, crtI 유전자의 발현이 필수적으로 요구되기 때문에 crtB, crtI 유전자의 경우는 P. haeundaensis에서 유래한 유전자를 이용하여 pRScrtBI 재조합 DNA를 구축하여 그 발현을 유도하였다. 상기 두 재조합 DNA를 대장균에서 공발현 시켰으며, HPLC 분석법을 이용하여 대장균 내에서 라이코펜의 생산 유무에 따른 KgGGPP synthase의 활성을 분석하였다.

• 미생물학회지
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• 제33권3호
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• pp.203-209
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• 1997

형질전환은 가장 먼저 연구된 유전물질 전이 기작으로(3,29,36), 자연적 형질 전환과 인위적 형질 전환으로 구별할 수 있다. 자연적 형질 전환은 세균에게서만 일어나며, 이때 수여체 세균은 적정 조건, 즉, 형질 전환 능력이 있는 생리적 상태(competene)가 되면 능동적으로 세포의 DNA를 받아들여 그들 유전 정보에 합치게 된다. 하지만 재조합 DNA 기술이 발달된 이후로 인위적 형질 전환이 원핵세포와 진핵세포에서 사용되었다(48). 자연적 형질 전환은 DNase와의 반응이 민감하다는 점에서 접합과 형질 도입과 구별된다. 형질 전화에 의한 유전자 전이가 세포으 DNA에 의해서 일어나는 한 DNase가 공격할 수 있고, DNA는 분해되어 형질 전환이 방해될 수 있다. 하지만, 형질 도입되는 DNA는 파지의 단백질막(capsid)에 보호되어 세포외로 절대 노출되지 않아 DNase에 의해서 영향을 받지 않고, 접합에서도 DNA는 세포와 세포의 접촉에 의해서 전이되어 공여체에서 수여체로 DNA가 전이될 때 역시 DNase에 노출되지 않고 일어날 수 있다.

• 유기물자원화
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• 제11권4호
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• pp.49-56
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• 2003

토양미생물인 Ralstonia eutropha JMP134는 세균의 염색체상의 페놀분해경로를 통하여 삼염화에틸렌(TCE)을 분해하는 특징이 있다. 이전의 실험에서 본 세균으로부터 분리된 페놀분해효소가 단독으로 삼염화에틸렌을 분해하는 것을 밝힌바 있다. 본 실험에서는 페놀분해효소를 생성하는 유전자를 유전자 재조합방법을 통하여 plasmid에 cloning한 유전자 재조합세균 R. eutropha AEK301을 대상으로 TCE의 분해능을 실험하였다. AEK301은 페놀에 의한 유도작용 없이도 여러 유기물의 존재하에서 TCE를 분해하는 것으로 나타났다. 본 세균은 0.05%의 에탄올이 유일한 탄소원으로 제공된 배양액에서 TCE의 농도 $200{\mu}M$ 까지 거의 분해하였으며 농도 $400{\mu}M$에서는 약 70%까지 제거하는 특성을 보여주었다.