포플러류(類)에 대(對)한 유용유전자(有用遺傳子) 삽입에 관(關)한 기초(基礎) 연구(研究)로서, 북미(北美)의 자연잡종(自然雜種) 포플러, P. alba ${\times}$ P. grandidentata 3 클론을 대상으로 Agrobacterium tumefaciens A281과 A348 strain의 감염력을 조사(調査)하였다. Kanamycin 저항성(低抗性)의 neomycin phosphotransferase (NPT-II) 유전자(遺傳子)를 가진 Agrobacterium binary pGA 472 vector와 이들 조직배양(組織培養)된 세 클론의 잎조각을 함께 배양(培養)하여, 형질전환(形質轉換)된 부위(部位)를 선발(選拔)하기 위해서 kanamycin sulfate의 적정농도(適正濃度)를 조사(調査)하였다. A281과 A348 strain 중(中) A281 strain이 가지고 있는 pTiBo542가 binary vector system의 helper plasmid로서의 역할에 가장 적합한 것으로 나타났다. 비교적 저농도(低濃度)(10mg/l)의 kanamycin sulfate가 잎조각배양으로 부터 식물체(植物體) 유도를 억제하였다. Kanamycin 저항성(低抗性) 유전자(遺傳子)가 내포된 Agrobacterium binary vector와 잎조각을 함께 배양(培養)한 후(後) kanamycin에 대한 저항성(低抗性)을 가진 callus가 kanamycin(60mg/l)이 들어있는 식물체 유도배지에서 선발(選拔)되었다. Kanamycin 저항성(低抗性) 유전자(遺傳子)에 의해 형질전환된 이들 kanamycin 저항성(低抗性) callus와 정상적인 비교 callus를 kanamycin이 들어있는 식물체(植物體) 유도배지에서 배양(培養)했을때 정상적인 비교 callus는 50mg/l의 kanamycin 농도(濃度)에서 생장(生長)이 억제된 반면, 형질전환(形質轉換)된 kanamycin 저항성(低抗性) callus는 200mg/l의 kanamycin 농도(濃度)에서도 생장(生長)을 계속하였다.
큰개현삼(Scrophularia kakudensis)과 근연분류군인 좀현삼(S. kakudensis var. microphylla), 일월토현삼(S. pilosa) 및 몽울토현삼(S. cephalantha)을 대상으로 원기재문과 기준표본에 근거하여 외부 형태학적 연구를 수행하였다. 줄기 마디의 수, 잎의 크기, 개화기의 차이, 화서의 발달유형 및 줄기와 잎에 털의 분포 양상 등은 큰개현삼과 근연종들의 분류에 매우 유용한 형질로 밝혀졌다. 큰개현삼은 개화기가 7-9월이고, 줄기에 7개 이상의 마디를 가지며, 화서는 정단과 엽액에서 발달하는 특징을 가진다. 반면에 몽울토현삼은 개화기가 5-6월이고, 줄기에 3-6개의 마디를 가지며, 화서는 정단에만 짧게 발달하는 특징을 가짐으로써 큰개현삼과 뚜렷이 구분되었다. 변이의 폭이 큰 큰개현삼 집단과는 달리 좀현삼은 모두 소형화된 집단을 형성하기 때문에 현재 분류계급(var. microphylla)을 유지하는 것이 타당하다. 또한 일월토현삼은 액생화서, 줄기 및 잎의 흰털이 주요식별형질로 알려져 왔지만, 기준표본 및 기준표본지 조사에서 이들 형질들이 큰개현삼의 형질 변이 폭 내에 포함되므로 큰개현삼의 이명으로 처리하였다.
본 연구에서는 한국산 참나무속 참나무아속(Quercus subgen. Quercus) 6종 및 종간 잡종으로 추정되는 개체들을 대상으로 잎, 동아, 소지, 견과, 각두 및 포린의 형태 및 크기에 관한 40개의 형질들을 측정, 수리분류학적 분석(주성분분석)을 수행하여 주요 형태 형질의 변이 양상을 파악하고, 한국산 참나무아속 분류군들의 실체를 이해하고자 하였다. 그 결과, 본 아속 한국산 개체들은 크게, 1) Q. acutissima-Q. variabilis, 2) Q. dentata, 3) Q. aliena, 4) Q. mongolica, 그리고 5) Q. serrata 개체들로 구성된 5개의 집단으로 구분되었고, 종간 잡종으로 추정되는 개체들은 대부분 추정 부모종의 중간적 특징을 갖는 것으로 밝혀졌다. 주성분분석에서 하나의 집단을 형성하면서 약하게 구분되는 Q. acutissima와 Q. variabilis는 잎 하면 털의 종류 및 분포 양상에 의해 뚜렷이 식별되는 것으로 나타났다. 또한, 외부형태 형질의 경우, 잎의 형태, 엽신의 길이와 폭, 거치의 크기와 형태, 소지의 직경, 견과의 길이와 폭의 비, 포린의 길이와 폭 등이 참나무아속 한국산 분류군들을 구분하고 잡종 형성을 이해하는데 매우 유용한 것으로 밝혀졌다.
본 연구는 호랑버들과 갯버들 교잡종의 잎 형태적 특성을 국내 자생종인 호랑버들, 갯버들과 비교하였다. 호랑버들 35개체, 갯버들 35개체, 교잡종 100개체에서 잎을 채취하여 잎의 길이와 너비, 엽저와 엽두 각도, 잎자루 길이와 너비, 탁엽의 길이와 너비, 잎 두께 등 총 17개의 잎 형태적 특성을 분석한 결과, 엽두 각도와 탁엽의 길이를 제외한 15개의 특성에서 세 분류군이 유의한 차이를 나타내었다. 교잡종의 잎 길이와 너비의 비는 갯버들, 교잡종, 호랑버들 순으로 크게 나타나 교잡종의 잎의 형태는 피침형인 갯버들과 타원형인 호랑버들 사이 중간 형태로 나타났다. 교잡종의 잎의 너비, 엽저 각도, 잎자루의 길이와 너비, 탁엽의 길이와 너비는 호랑버들과 갯버들의 중간 형태를 나타내었으며, 탁엽의 거치 개수는 교잡종이 호랑버들과 갯버들보다 많은 특성이 나타났다. 잎 뒷면 단위면적당 털의 개수 또한 교잡종이 호랑버들과 갯버들보다 많은 특성을 나타냈다. 세 분류군 간 잎 형태적 차이를 구명하기 위해 유의한 차이를 보인 15개의 변수를 이용하여 주성분분석을 실시한 결과 고유값이 1 이상인 제 1, 2, 3, 4주성분이 전체 분산의 68.2%를 설명하였다. 제 1주성분은 잎의 너비, 잎의 1/3 아랫부분 너비, 잎의 1/3 윗부분 너비, 잎자루의 길이, 잎의 길이로 잎의 크기와 관련이 있는 특성들이 높은 상관관계를 나타내었고, 제 2주성분은 엽맥의 수, 잎자루의 너비와 높은 상관관계를 나타내었다. 제 3주성분은 탁엽의 거치 개수, 탁엽의 너비로 탁엽의 특성과 관련이 있는 특성들이 높은 상관관계를 나타내었으며, 제 4주성분은 잎의 두께와 높은 상관관계를 나타내었다. 주성분분석 결과 호랑버들과 갯버들 교잡종의 잎 특성은 호랑버들보다 갯버들과 가까운 것으로 나타났다. 잎의 형태적 특성으로 세 분류군을 구별하기 위해 정량형질을 이용한 판별분석 결과 교잡종 중 대부분(93.3%)이 호랑버들, 갯버들과 구별되었다. 일부 교잡종 개체(6.7%)가 갯버들로 오분류되었지만, 잎의 정성적 특성인 잎의 거치와 측맥의 특성을 고려한 결과 모든 개체가 교잡종으로 구분되었다. 따라서 호랑버들과 갯버들의 교잡종은 잎의 형태적 특성이 부모종인 호랑버들, 갯버들과 다른 독특한 형태를 가진 것으로 나타났다.
태백제비꽃파 근연 분류군인 단풍제비꽃과 남산제비꽃의 종간 유연관계를 알아보기 위하여 극단적인 형태를 보이는 7개 집단에 대해 외부형태학적, 화분학적, 해부학적 형질에 대한 분류학적 연구와, 국내에 분포하는 분류군을 비롯하여 유럽, 중국과 일본에 분포하는 근연 분류군을 포함한 28개 집단에 대한 핵 DNA의 ITS와 V. pinnata를 제외한 27집단에 대한 엽록체 DNA의 trnL-F 지역에 대한 분자계통학적 연구를 수행하였다. 외부형태학적 형질에서 엽연 거치의 수, 화피의 크기, 주두와 종자의 형질 등은 형태가 유사하거나 중복되는 형질을 갖는 것으로 나타나 구분이 불가능 하였으나 잎의 모양에 의해서는 두 그룹으로 유집되었다. 화분은 단립으로 극면입상은 반각형이었고, 발아구는 3공구형이며, 표면의 돌기는 미립상, 표면무늬는 난선상으로 집단간 유사한 특징을 보였다. 화분입상은 5개 집단이 장구형으로 관찰된 반면 단풍제비꽃 type 1과 남산제비꽃 type 3은 아장구형으로 나타났다. 해부학적 형질에서 엽병, 화경, 뿌리와 주맥의 횡단면을 관찰한 결과는 7개 집단이 유사한 형태로 나타나 차이점을 찾을 수 없었으며, 기공은 모두 잎의 아랫면에만 존재하였고, 단위 면적당 기공의 수는 결각이 심할수록 많은 것으로 나타났다. 핵 DNA의 ITS지역에 대한 염기서열 분석 결과 V. pinnata와 V. dissecta는 단계통을 형성하였고 군외군으로 부터 가장 먼저 분지되어 독립된 분계조를 형성하면서 나머지 분류군들을 위한 자매군으로 유집되어 태백제비꽃과 근연 분류군을 위한 조상형으로의 가능성을 제시하였다. 그러나 태백제비꽃의 종내분류군과 V. eizanensis가 포함된 그룹은 뚜렷한 분계조를 형성하지 않았다. 이러한 결과는 엽록체 DNA의 trnL-F 지역에 대한 결과에서도 유사한 경향올 보였다. 이상의 결과에서 잎의 모양을 제외한 나머지 형질들은 태백제비꽃과 근연 분류군들을 구별하는데 유용하지 않은 것으로 확인되어 단풍제비꽃과 남산제비꽃은 태백제비꽃의 종하 분류군으로 취급하는 것이 타당할 것으로 판단된다.
본 실험은 nptII 및 hpt 유전자가 삽입된 현사시나무를 이용하여 각 항생제 저항성 유전자로 형질전환된 세포의 효율적인 선발 조건을 규명하기 위하여 수행되었다. 액아가 포함된 줄기절편과 잎절편 조직의 생장, 발근 유도, 캘러스 유도로 항생제에 대한 감수성에 대한 효과를 검정하였다. 형질전환되지 않은 대조식물체의 잎절편을 이용한 경우 50 mg/L의 kanamycin이나 2 mg/L hygromycin으로 캘러스 유도 및 생장을 억제할 수 있었으나 형질전환된 식물은 100 mg/L kanamycin, 50 mg/L hygromycin에서도 왕성한 생장을 나타냈다. 절간조직의 개아의 경우 100 mg/L kanamycin, 5 mg/L hygromycin으로 줄기신장을 완전히 억제 가능하였으며, 뿌리유도는 50 mg/L kanamycin, 5 mg/L hygromycin에서 선발이 가능하였다. 형질전환체는 모두 이보다 높은 농도에서 왕성한 생장을 보였다. 형질전환이 되지 않은 세포의 생장을 억제하는 데는 hygromycin이 kanamycin보다 더 효율이 좋은 것으로 나타났다. 따라서 hpt유전자가 npt II 유전자보다 훨씬 강력한 선발표지임이 확인되었으며 엽절편의 캘러스 유도와 생장과 절간조직의 발근유도 모두 항생제에 예민하게 작용하여 형질전환체의 식별에 효과적으로 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
국화과에 속하는 다년생 초본식물의 민들레가 Agrobacteria 에 대한 숙주로서의 가능성을 조사하고 여러 가지 유용한 유전자를 민들레로 도입시키기 위해, 민들레잎 절편을 pBI121으로 형질전환된 Agrobacterium tumefaciens LBA4404와 10분동안 공동배양하여 형질전환시킨 후, 1$\mu$M IAA, 1$\mu$M BA. 50 $\mu$g/ML Km과 100$\mu$g/ML Cb이 함유된 MS 배지에서 약 2주후에 multiple shoot를 유가시켰다. 유기된 shoot로 부터 유식식물체를 얻었으며, 형질전환을 확인하기 위해 GUS활성을 측정한 결과 양성 반응을 보였다.
사철쑥(Artemisia capillaris Thunb.)과 비쑥(A. scoparia Waldst. & Kit.)의 분류형질인 뿌리 형태, 잎 크기, 두상화서 크기는 사철쑥의 연속변이에 포함되어 두 분류군을 구분하는 유용한 형질이 아니며, 다른 분류학적 중요형질인 생육형에 있어서 관찰된 국내의 모든 표본과 생체들은 반관목 또는 다년초로서, 비쑥의 형질인 1, 2년초는 없는 것으로 확인되었다. 따라서 국내에 분포하는 개체 중 기존에 비쑥으로 알려진 다년초의 개체들은 사철쑥의 변이이며, 1, 2년초인 비쑥은 국내에 분포하지 않는 것으로 판단된다.
Agrobacterium-based vector를 이용하여 상추를 형질전환 및 재분화 하였다. 즉 $C_{a}$ MV 35S promoter와 GUS 유전자를 reporter로 가지고 있는 pBl121을 Agrobacterium tmfaciens LBA4404에 도입시킨 후 상추의 자엽 절편과 cocultivation을 통하여 형질전환 시키고 재분화 시켰다. Southern 및 Northern 분석을 통하여 형질 전환 및 재분화된 상추에 GUS 유전자가 안정하게 도입되고 식물체내에서 mRNA로 발현됨을 확인하였다. 또한 GUS 유전자가 식물 체내에서 단백질로 발현됨을 확인하기 위하여 상추 잎의 단백질 추출액을 이용하여 분광분석법에 의하여 GUS의 활성을 측정하였다. 시료간의 약간의 차이는 있으나 시료로부터 유의적인 GUS 활성을 확인하였다.
환경 스트레스에 의해 야기되는 활성 산소종에 의한 피해에 내성을 가지는 식물의 개발을 위하여 딸기 유래의 cytosolic ascorbate peroxidase 유전자(ApxSC7)를 Agrobacterium tume-faciens LBA4404를 매개로 형질전환 시켰다. Hygromycin으로 선발된 캘러스로부터 재분화 된 식물체는 야생형과 비교하여 형태적으로 차이를 나타내지 않았다. PCR 및 Southern blot 분석을 통하여 형질전환 식물체의 염색체 내에 ApxSC7 유전자가 integration 되었음을 확인하였다. 담배 잎으로부터 total RNA를 분리하여 Northern blot 분석을 실시한 결과, 도입된 유전자가 형질전환 식물체 내에서 지속적으로 발현된다는 것을 확인하였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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