용리 크로마토그래피를 사용하여 가수된 산화 망간(Ⅳ)이온교환체로 화학적 이온교환을 통하여, 리튬 동위원소를 분리하는 연구를 하였다. 산화 망간(Ⅳ)이온교환체의 이온교환 용량은 0.5meq/g이었다. 무거운 리튬 동위원소는 용액상에, 그리고 가벼운 동위원소는 이온교환 수지상에 농축되었다. 분리인자는, Glueckauf의 방법으로 용리곡선과 동위원서 분석 값들로부터 구하였다. $^6Li^+$-$^7Li^+$ 동위원소쌍의 분별로부터 얻은 분리인자의 값은 1.018이었다.
라이소자임은 용균 작용, 조직 회복 과정의 촉진 등의 작용을 하며 난백 중에 0.3% 함유되어 있다. 난백에서 라이소자임을 분리하는 방법으로 친화성 크로마토그래피, 이온교환크로마토그래피, 한외여과법 등이 있는데 이 중 이온교환크로마토그래피가 가장 많이 사용된다. 라이소자임을 양이온 젤이 충전된 유리 칼럼에서 분리 정제할 때 최적의 pH와 온도 조건을 찾는 것을 실험 목표로 하고, ASPEN Chromatography 전산 모사의 결과와 비교하였다. 실험에 사용되는 완충용액은 인산완충용액이었고 pH를 5~8로 변화를 주어 상온에서 실험하였고, 가장 분리가 잘 이루어진 pH에서 온도를 $5^{\circ}C$ 간격으로 $25{\sim}40^{\circ}C$로 변화시켜 실험하였다. RP-HPLC (Reversed phase High Performance Liquid Chromatography) 분석을 통해 라이소자임의 체류 시간을 확인하였고, OriginPro 8을 이용해 용출 단계에서 크로마토그램의 면적을 비교하여 라이소자임의 양을 정량분석하였다. 결과를 분석한 결과, pH 5일 때, 온도가 $25^{\circ}C$에서 가장 많은 양의 라이소자임이 분리되었다.
새로운 분리공정으로써 크로마토그래피를 이용하고자 하는 노력들이 활발하게 진행되어지고 있는 가운데, 기존의 전통적인 크로마토그래피를 더욱 발전시킨 시도들이 행하여지고 있다. 여기에 부합하여 약 20여년 전부터 연구되기 시작한 Displacement ion-exchange chromatography는 현재 활발한 연구가 진행되어지고 있으며, 전형적인 preparative chromatography에 비해 많은 장점을 가지고 있다. Displcement ionexchange chromatography는 displacer를 사용하여, 고농도의 원료 물질을 효율적으로 단시간내에 처리할 수 있는 공정으로 기존의 preparative chromatography의 문제점이었던 꼬리끌기 현상과 희시현상을 대폭 감소시킬 수 있게 되었다. 따라서, displacement ion-exchange chromatography 공정에서의 가장 큰 과제인 비선형 등온선 영역에서의 거동과 분리공정 조작선의 결정 및 고성능의 displacer에 대한 연구가 요구되어지고 있으며, 본 총론에서는 이온교환 크로마토그래피 공정에서 displacement ion exchange chromatography를 이용한 단백질의 분리에 대하여 고찰하고자 한다.
리튬 동위원소의 분리를 위하여, 양이온 교환 컬럼 크로마토그래피를 수용액 이온 교환시스템 중에서 수행하였다. 실험에는 길이 50cm, 안 반지름 6mm의 파이렉스 유리 컬럼을 사용하였다. 컬럼 크로마토그래피에서 용리액으로는 염산 숙신산 혼합용액을 사용하여 1.0068의 분리인자 값을 얻었다. 이 실험으로부터 가벼운 $^6Li$는 수지상에 농축되고, $^7Li$는 용액상에 농축됨을 확인하였다.
난백에 있는 40여 가지의 단백질의 기능적 특성에 대한 연구가 폭 넓게 진행되고 있지만, 그 특성이 모두 확인되지 않았다. 난백에서 순수하면서 변성되지 않은 단백질을 분리하는 방법을 연구하기 위해 본 연구에서는 난백 중 함량이 많은 lysozyme, ovotransferrin, ovalbumin을 분리했다. 난백에서 단백질을 다른 분리 방법보다 선택적으로 분리가 가능한 이온 교환 크로마토그래피를 이용했다. 그리고 분리된 단백질을 동정하기 위해서 Reversed-phase HPLC (RP-HPLC)를 사용했다. 이온 교환 크로마토그래피에서 HI Trap ion exchange cartridge (GE Healthcare, USA)를 사용했고, 그 중에서 양이온 교환 수지 SP (완충용액 pH 8.0, pH 5.2)와 음이온 교환 수지 Q (완충용액 pH 8.0)로 난백 단백질을 분리하였다. 분리한 난백 단백질들의 동정용 RP-HPLC에서는 C18 컬럼(Phenomenex, USA)을 사용했고 등용매 용리에서 이동상으로 acetonitrile (ACN)/distilled water (DW)/trifluoroacetic acid (TFA)의 부피비를 50/50/0.1로 사용했다. 이온 교환 크로마토그래피에 의해 각 단계에서 분리된 용출용액을 RP-HPLC으로 분석한 크로마토그램과 표준시료의 크로마토그램의 체류시간을 비교하여 난백에 포함된 ovotransferrin, ovalbumin, lysozyme이 순차적으로 용출됨을 알았다.
본 연구에서는 난백에 포함된 라이소자임의 컬럼 크로마토그래피에서의 breakthrough behavior 실험을 통해 최적 크로마토그래피 분리조건을 결정하였다. 다양한 양이온 교환수지의 라이소자임 breakthrough behavior를 비교한 결과 Cellufine C-200(Amicon, USA)이 라이소자임 흡착에 가장 우수한 성능을 보였다. Cellufine C-200 수지에서 이온강도, pH, 선속도 등이 난백 라이소자임의 breakthrough behavior에 미치는 영향을 비교한 결과 conductivity 2.75 mS/cm, pH 7, 선속도 0.635cm/min의 최적 조건을 얻었다. 본 최적조건에서 prep 규모 컬럼 크로마토그래퍼를 이용 난백으로부터 라이소자임을 분리하였다. 정제된 라이소자임과 Sigma 라이소자임의 specific activity는 비슷하였으며 SDS-PAGE 분석 결과 본 연구에서 정제된 라이소자임이 Sigma 라이소자임보다 impurity 단백질들을 적게 포함하고 있음을 확인하였다.
분리막 공정은 상변화를 일으키지 않기 때문에 장치비가 저렴하며, 열 및 화학적으로 민감한 물질, 특히 생체물질 등을 다루는데 적합하다. 또한 최종 생성물질을 정제하는 방법으로는 이온교환 크로마토그래피, 전기 영동 및 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)가 있다. 이중 친화성 크로마토그래피는 가장 선택적이고, 단일 장치로서 기존의 분리방법에 비해 약 1000배 가까이 정제할 수 있다. 본 실험에서는 트립신 억제제인 m-aminobenzamidine을 포함하고 있는 수용성 고분자를 제조하여 트립신을 선택적으로 분리하고자 하였으며, 본 연구 필요한 분리막은 막제조가 용이하며 비용이 저렴한 cellulose acetate막을 사용하였다. CA 막의 세공크기는 겔화매질의 에탄올 농도로 조절하였다. Casting 용액의 조성은 다음 표에 간략하게 나타내었다.
방사성 폐기물 핵종 재고량 평가에 필요한 핵종분석을 위하여 다양한 매질의 방사성 폐기물 시료로부터 $^{99}Tc,\;^{94}Ng,\;^{55}Fe,\;^{90}Sr$ 및 $^{59/63}Ni$의 분리에 관한 연구가 수행되고 있다. Ni은 음이온교환 수지와 Sr-Spec 추출 크로마토그래피 수지로 Re($^{99}Tc$의 대용물), Nb, Fe 및 Sr을 차례로 분리하는 과정에서 Ca, Mg, Al, Cr, Ti, Mn, Ce, Na, K 및 Cu와 함께 회수되었다. 본 연구에서는 Ni의 선택적 분리기술을 확립하기 위하여 Ni-Spec 추출 크로마토그래피 및 양이온교환수지법으로 이들의 분리거동을 비교하였다. 또한 Ni의 정제와 기체비례계수법으로 방사능을 측정하기에 적합한 계측시료 준비를 위하여 ammonium $citrate/ethanol-H_2O$ 및 tartaric $acid/acetone-H_2O$에서 dimethylglyoxime(DMG)에 의한 Ni의 침전거동을 조사하였다 원자력발전소로부터 채취한 폐이온교환수지 시료 용해용액의 화학조성을 모사하여 만든 모의 폐이온교환수지 용액을 사용하여 Re, Nb, Fe 및 Sr 분리과정을 거쳐 최종적으로 분리한 Ni의 회수율은 $92.1\%\;(RSD:\;0.9\%)$이었다. 또한 tartaric $acid/acetone-H_2O$에서 DMG에 의한 Ni의 회수율은 $85.6\%\;(RSD:\;1.9\%)$이었다.
본 연구에서는 다중 이온교환크로마토그래피로 리소짐을 분리하는 공정개발을 위해 Cellufine CM C-200과 Bio-rex 70 겔을 이용하여 비교 실험하였다. 난백에서 Iysozyme의 분리, 정제 및 수지의 활용성을 확인하는 실험이었다. 실험결과 Cellufine겔은 5 주기가 지나면서부터 용출분획에서 낮은 농도의 단백질이 용출됨을 확인하였다. 이는 주기가 진행될 수록 겔의 흡착능력이 약화됨을 보여주는 것이다. 또한 주기가 진행될수록 각 주기의 크로마토그램을 분석한 결과, 단백질이 겔의 작용기와 효과적으로 흡·탈착 작용을 하고 있지 못하기 때문에 용출영역의 peak가 계속해서 낮아지는 경향을 보였다. 그러나 Bio-rex 70겔은 6 주기를 수행 후에도 겔의 흡착능력이 상실되지 않고 단백질과 효과적으로 결합함을 용출영역의 크로마토그램과 전기영동에서 확인하였다. Bio-rex 겔은 Cellufine겔보다 단백질과 작용기와의 결합력이 우수하였으나 순수한 Iysozyme의 정제에 있어서 적당하지 못함을 알 수 있었다. Iysozyme의 용출 이온강도가 다른 단백질들보다 더 강하기 때문에 용출용액의 소금 농도구배를 실행함으로써 단백질을 용출한다면 순수한 IysoByme을 정제할 수 있다고 생각된다. 따라서 본 실험결과 다중 이온교환크로마토그래피 공정에 효과적인 겔은 Bio-rex 70겔임을 알 수 있었다.
자연수에는 무기이온, 용해유기물, 미립자, 미생물과 같은 성분들이 혼재되어 있다. 일반실험실에서 사용하는 증류수, RO수 또는 이온교환수는 실험용 기구 세척수, 일반 정성화학 실험 등에는 적당하지만, 최근 급속히 발전하는 생명공학의 조직배양용이나 PHLC, AAS, 이온크로마토그래피 등 정밀분석기기 용수로는 부적당하다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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