• 생명과학회지
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• 제14권4호
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• pp.644-649
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• 2004

GA 생합성에 결정적 역할을 하는 GA 3$\beta$-hydroxylase를 pIG121-Hm 벡터에 GUS유전자를 빼고 antisense로 클로닝하여 이를 동진벼에 도입한 결과 17개체의 절간신장이 억제된 형질전환한 식물체를 얻을 수 있었다. 일반 재배 동진벼를 대조군으로 하여 비교하였을때 antisense GA 3$\beta$-hydroxylase 유전자가 형질 도입된 식물체의 획득형질은 평균적으로 대조군에 비해 절간 신장의 억제가 확인되었다. 절간신장의 억제가 보인 개체의 엽육조직을 co취하여 Southen blot hybridization분석 결과 3개의 line에서 모두 single copy로 도입된 것으로 나타났다. 이로써$T_o$ 식물체 내에 antisense GA 3$\beta$-hydroxylase 유전자를 내포하고 있는 것으로 확인되었다. 이것은 antisense GA 3$\beta$-hydroxylase 유전자가 생체내에서 직접 또는 간접적으로 GA 3$\beta$-hydroxylase유전자의 발현에 관여한 것이라 사료되어진다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제43권4호
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• pp.450-456
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• 2016

한국형 잔디에서는 다른 병에 비해 진전 속도가 빠르고 주로 뿌리에서부터 발병하여 잔디를 고사시키고 발병 후 구제하기 매우 어려운 라이족토니아잎마름병(라지패취)이 큰 문제로 대두되고 있다. 라이족토니아잎마름병(라지패취)은 Rhizoctonia solani AG2-2 (IV)병원균에 의해 발생하는데, 이 병원균에 강한 내병성 들잔디를 개발하기 위해 식물방어반응에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 PR-Protein 중 하나인 ${\beta}-1,3-glucanase$를 들잔디로부터 클로닝 하였다. ${\beta}-1,3-glucanase$는 바이러스나 균의 감염으로 인해 식물조직이 과민반응을 일으킬 때 세포내에서 생성되고 세포 외로 분비되어 세포 사이 공간에서 주로 병원균 저항성기능을 하는 것으로 알려져 있다. ${\beta}-1,3-glucanase$ 단자엽식물 중 내병성에 대한 연구가 되어있는 옥수수, 밀, 보리, 벼의 염기서열에서 공통으로 보존되어 있는 부분을 이용해 degenerate PCR을 수행하고 얻어낸 sequence를 통해 Full-length의 cDNA를 클로닝 하였다. E.coli overexpression을 수행하여 목표 단백질을 대량 정제하여 in vitro 활성 측정 및 항균테스트를 진행하였다. 또한, ZjGlu1 유전자의 기능을 해석하기 위해 각각의 유전자를 도입한 식물형질전환용 벡터를 제작하여 잔디 형질전환체 제작을 하였다. ZjGlu1 단백질을 이용하여 9개의 균주에 대해 항균활성 테스트를 진행 한 결과 R. cerealis, F. culmorum, R.solani AG-1 (1B), T. atroviride 에서 항균활성을 보였으며, 형질전환체를 이용해 18s 유전자의 발현량을 상대로 한 각 유전자의 기관별 발현량은 크게 차이없이 모든기관에 발현되는 것을 확인할 수 있었다.

• 생명과학회지
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• 제30권1호
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• pp.88-95
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• 2020

유기용매 내성 세균인 Pseudomonas sp. BCNU 106을 10%(v/v) 톨루엔에 노출시킨 후 8시간 동안 random arbitrarily primed polymerase chain reaction (RAP-PCR)기법을 이용하여 메신져 RNA 발현 레벨을 조사하였다. 총 100개의 상향발현된 발현 산물 중에서 50개의 상보적인 단편들이 반복적으로 재현성있게 발현되는 것으로 확인되어, 이들을 클로닝을 하였으며 나아가 유전자 염기서열을 결정하였다. Blast analysis 결과, 톨루엔은 LysR family transcriptional regulator 그리고 RNA polymerase factor sigma-32같은 전사와 관련된 유전자들의 발현 레벨을 적응적으로 증가시키는 것으로 확인되었다. 그리고 톨루엔 스트레스 존재 하에서 inorganic ion 수송과 대사와 관련된 catalase와 Mn²⁺/Fe²⁺ transporter 유전자의 발현이 증가되었으며, 신호전달과 대사와 기능적으로 관련된 type IV pilus assembly PilZ와 multi-sensor signal transduction histidine kinase 유전자들의 발현 증가도 확인되었다. 한편 톨루엔 노출 후 탄수화물 수송과 대사와 관련된 beta-hexosaminidase 유전자발현 레벨이 증가하였다. 나아가 DNA polymerase III subunit epsilon, DNA-3-methyladenine glycosylase II와 DEAD/DEAH box helicase domain-containing 유전자들과 같은 DNA 복제, 재조합 그리고 수복에 관련성이 있는 유전자들의 발현 레벨 그리고 심지어는 ABC transporter 유전자와 같은 방어 메커니즘에 관련성이 있는 유전자들의 발현 레벨이 적응적으로 증가되는 것으로 밝혀졌다. 특히 10% 톨루엔 존재하에서 ABC transportor, Mn²⁺/Fe²⁺ transporter 및 β-hexosaminidase 유전자에 해당하는 RNA들이 괄목하게 유도되는 것이 확인되었다. 그러므로 유기용매 내성 세균 Pseudomonas sp. BCNU 106이 유기용매에 대하여 내성을 나타내는데 있어서 방어 메커니즘, 세포내 이온 항상성 그리고 바이오 필름 형성이 필수적인 것으로 확인되었다.

• 대한의생명과학회지
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• 제6권1호
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• pp.73-82
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• 2000

양끝이 같은 형태로 이루어진 DNA조각들은 벡터에 두 가지 방향으로 삽입될 수 있다. 기존의 방법으로는 이들의 방향성을 알아내기 위하여 제한효소의 처리 혹은 DNA염기서열 분석법이 수행되어졌는데, 이들은 적절한 제한효소 인식 부위의 부재 혹은 높은 가격과 많은 샘플수 등으로 그 이용범위가 어느 정도 제한되어 있었다. 본 연구에서는, 벡터에 클로닝 된 DNA조각의 방향성을 결정하기 위한 새로운 실험기법과 이에 따르는 구체적인 방법을 기술하고 이의 직접적인 이용을 보고하고 있다. 통상적인 염기서열 분석용 oligonucleotide primer와 중합효소 연쇄반응용 (PCR) primer를 이용한 PCR에 기초한 이 방법은, 여러 후보 클론의 플라스미드 DNA를 주형으로 하여 한 차례의 반응으로, 원하는 방향으로의 DNA조각이 삽입된 클론을 찾아낼 수 있게 한다. 이 실험기법의 용이함과 정확성은 최근에 보고된 바 있는 랫트의 신경 펩타이드인 urocortin의 cDNA를 재조합 발현 벡터상에 클로닝하고 분석하는 것으로 증명할 수 있었다. 이 같은 방법으로 찾아진 유전자 재조합 클론들은 추가적인 실험을 통하여 CHO 세포주에 transfection 되었는데, 이들이 실제로 urocortin을 발현함은 면역효소 측정법으로 검증될 수 있었고, 이를 통하여 최초로 이 40개의 아미노산으로 이루어진 짧은 펩타이드를 진핵 세포상에서 재조합 단백질의 형태로 발현시키는 데 성공하였다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제36권3호
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• pp.182-188
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• 2008

내열성 Trehalose synthase를 생산하는 초고온성 균주 HJ6은 일본 Arima 온천수에서 분리하였다. 세포의 길이는 $2{\sim}4\;um$, 직경 0.4 um의 간균으로 생육최적 pH와 온도는 각각 6.5와 $80^{\circ}C$이였다. 분리된 균주의 16s rRNA 염기서열을 분석하고 계통학적으로 분류한 결과, HJ6 균주는 Thermus thermophilus에 속하는 것으로 동정되었다. PCR법을 이용하여 trehalose synthase(TS) 유전자를 클로닝하고 염기서열을 분석한 결과, ORF는 2,898개의 뉴클레오타이드로 구성되고 915개의 아미노산을 암호화하였다. 아마노산 서열을 바탕으로 상동성을 분석한 결과, Thermus caldophilus GK24 유래 TS와 99%, Meiothermus ruber 유래 TS와 83%의 identity를 나타내었다. 이 유전자를 온도감수성 프로모터를 포함하는 pJLA503 벡터를 이용하며 대장군에서 발현하고 정제하여 약 110 kDa 단백질을 얻을 수 있었다. 정제된 효소는 트레할로스 전환활성에 대한 최적 pH가 7.5이고, 최적온도는 $80^{\circ}C$이며, 활성의 반감기는 $90^{\circ}C$에서 40분으로 확인되어 높은 내열성을 가지는 것으로 확인되었다. 본 효소의 트레할로스 최대 전환율은 기질농도 500mM에서 55.7%를 나타내었고, 기질 농도가 증가함에 따라 더불어 증가하였기 때문에 본 효소의 트레할로스 전환율을 기질농도에 의존적인 것으로 생각되었다.

• 생명과학회지
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• 제17권9호통권89호
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• pp.1197-1203
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• 2007

세균인 Paenibacillus sp. DG-22의 유전체 DNA library가 제조되었으며, ${\beta}-xylosidase-$양성 클론이 형광기질인 $4-methylumbelliferyl-{\beta}-D-xylopyranoside$ $({\beta}MUX)$를 사용하여 확인되었다. 이 클론으로부터 재조합 플라스미드가 분리되었고 삽입된 4.3-kb 크기 DNA의 염기서열이 결정되었다. ${beta}-xylosidase$ 유전자는 분자량이 78.710 dal-ton이고 pI가 5.0인 701개의 아미노산을 암호화하는 2,106 염기쌍의 열린해독틀(ORF)로 구성되어있었다. xylA 유전자산물의 추론된 아미노산 서열은 과(family) 52에 속하는 클리코실 가수분해효소로 분류된 ${beta}-xylosidase$들과 상당한 유사성을 가지고 있었다. 이 xylA 유전자에 6개의 히스티딘-꼬리표를 붙이기 위해 pQE60 발현벡터에 다시 클로닝하였다. 재조합 ${beta}-xylosidase$ $(XylA-H_6)$가 열처리와 고정화금속친화성 크로마토그래피(IMAC)에 의해 순수하게 정제되었다. $XylA-H_6$ 효소의 최적 pH와 온도는 각각 pH 5.5-6.0과 $60^{\circ}C$이었다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제37권1호
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• pp.17-23
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• 2009

PCR법을 이용하여 Thermus thermophilus HJ6 유래 DNA polymerase(Tod) 유전자를 클로닝하고 염기서열을 분석한 결과, ORF는 2,505개의 뉴클레오타이드로 구성되고 834개의 아미노산을 암호화하였다. 아마노산 서열을 바탕으로 상동성을 분석한 결과, Thermus thermophilus HB8 유래 DNA polymerase와 98%, Thermus aquaticus 유래 DNA polymorase와 86%의 identity를 나타내었다. 이 유전자를 박테리오파지 $\lambda$ 유래 온도감수성 프로모터(PR, PL)를 포함하는 pJLA503 벡터를 이용하여 대장균에서 발현하였다. 발현된 효소는 열처리, $HiTrap^{TM}$ Q column과 $HiPrep^{TM}$ Sephacryl S-200 HR 26/60 columun으로 정제하여 94 kDa의 단백질을 얻을 수 있었다. 정제된 효소의 DNA 중합 활성에 대한 최적온도는 $75{\sim}80^{\circ}C$이고 최적 pH가 9.0이었다. $Mg^{2+}$ and $Mn^{2+}$에 대한 최적 농도는 각각 2.5mM과 1mM이었고 효소활성은 2가 양이온의 존재 하에서는 활성화 되지만 1가양이온에서는 저 해되었다. Tod DNA 중합효소를 이용한 PCR 실험결과, Tod DNA 중합효소는 DNA 증폭 및 PCR 관련 기술에 응용 가능할 것으로 생각된다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제41권2호
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• pp.153-159
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• 2013

Sinorhizobium meliloti 1021 (KCTC 2353) 유전체로부터 mannitol dehydrogenase (SmMDH)로 추정되는 유전자를 클로닝하고, 대장균에서 대량 발현하였다. 이 유전자는 494개의 아미노산(약 54 kDa)을 암호화하는 1,485 bp의 염기로 구성되며, 기존에 보고된 long-chain dehydrogenase/reductase 계열 MDH 효소들과 약 35-55%의 아미노산 서열상동성을 나타내었다. 재조합 SmMDH의 최적 반응온도는 $40^{\circ}C$이며, pH 7.0의 조건에서 최대의 D-fructose 환원활성, 그리고 pH 9.0에서 최대의 D-mannitol 산화활성을 보였다. 특히, 이 효소는 $NAD^+/NADH$ 조효소의 존재 하에서 산화 환원 활성을 나타내며, $NAD^+/NADPH$는 조효소로 이용하지 못하였다. 결론적으로 SmMDH는 전형적인 $NAD^+/NADH$-의존형 mannitol dehydrogenase (EC 1.1.1.67)임을 확인하였다.

• 생명과학회지
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• 제27권6호
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• pp.617-622
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• 2017

본 연구에서는 zebrafish에 사람의 cyt $b_5$ 유전자를 microinjection하여 발현시키고, 그 결과를 형광으로 확인하였다. HeLa cell에서 RT-PCR을 진행한 결과 414 bp의 cyt $b_5$ band가 증폭되었다. 염기서열 분석으로 재확인된 cyt $b_5$ insert를 pEGFP-N3의 형광 vector에 클로닝하였고, 이렇게 준비된 pEGFP-N3-cyt $b_5$ plasmid DNA를 1세 포기의 수정란에 microinjection하였다. cyt $b_5$를 microinjection한 치어를 형광현미경으로 관찰한 결과 대조군 치어보다 훨씬 선명한 형광을 띠는 것이 확인되었다. 최종적으로 치어에서 RNA를 분리하여 RT-PCR하였고 전기영동과 DNA sequencing으로 fusion 단백질의 발현을 재확인하였다. Cyt $b_5$의 발현으로 인해 zebrafish의 생존율이 다소 떨어지는 것으로 확인되었기에 독성 문제를 해결하기 위한 연구가 계속 필요할 것으로 사료된다. 이 연구는 향후 cyt $b_5$가 결핍되었을 경우 발생할 수 있는 여러 질병들을 유전자 차원에서 치료하고, 유용 유전자 클로닝을 위한 기술 개발에 발판이 될 수 있을 것으로 기대된다.

• 미생물학회지
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• 제48권4호
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• pp.293-297
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• 2012

극지의 다양한 환경으로부터 분리되어 극지연구소 PAMC(Polar and Alpine Microbial Collection)에 보관중인 169개 균주들을 0.4% colloidal chitin이 첨가된 ZoBell 고체배지에서 배양하여 chitinase 활성을 균주 27개를 선별하였다. 그 중 PAMC 21693 균주는 저온에서 pNP-$(GlcNAc)_1$를 기질로 사용했을 때 가장 큰 활성을 보였고, $4-37^{\circ}C$의 온도 범위 중 $4^{\circ}C$에서 가장 높은 개체수 증가율을 보였다. PAMC 21693의 chitinase 유전자를 클로닝한 결과 2,619 bp의 ORF를 포함하는 총 2,857 bp의 염기서열을 확보하였다. 대장균에서 chitinase 유전자의 재조합 단백질을 발현한 결과 분자량 96 kDa의 재조합 단백질을 확인할 수 있었다. 본 논문에서는 극지 미생물 유래 저온활성 chitinase들의 생물공학 분야에서의 이용가능성을 제시하였다.