• 미생물학회지
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• 제40권4호
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• pp.359-363
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• 2004

자연계에 존재하는 미생물의 대부분이 배양이 불가능하다는 것이 밝혀진 이후, 자연계의 시료로부터 직접 유전자를 클로닝하여 유용유전자를 발굴하는 메타제놈(metagenome) 이용 방법이 주목을 받게 되었다. 그러나 실제로 오염이 심한 환경시료로부터 DNA를 추출하여 유용한 메타제놈 라이브러리(metagenomic library)를 제작하기란 쉽지 않은 일이다. 따라서 본 연구에서는 실제 메타제놈 라이브러리를 제작할 때 만나는 기술적 문제점에 대한 해결 방법을 탐구하였다. 메타제놈 라이브러리 제작에는 fosmid vector가 가장 편리하였으며, 성공적인 라이브러리제작에는 fosmid vector에 클로닝이 가능한 40 kbp 크기의 DNA 조각을 얻는 과정이 중요함을 알았다. 여러 실험 조건을 종합적으로 검사한 후 메타제놈 라이브러리 제작에 대한 최적 방법을 제사하였다.

• 수산해양교육연구
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• 제26권3호
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• pp.543-552
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• 2014

Papain family중 하나인 cysteine protease는 근골격계 질환 치료를 위한target molecule로 인식 되어왔으며 Cathepsin B 는 단백질 분해의 초기과정에 관여하는 cysteine proteases 중 하나이다. 본 연구는 넙치의 cathepsin B 유전자의 발현 양상과 넙치 cathepsin B(PoCtB)의 클로닝, 발현 및 효소특성을 분석하였다. cDNA Library Screening을 이용하여 넙치의 cDNA를 클로닝하였다. 넙치의 동정된 cathepsin B 유전자는 993bp의 open reading frame과 330개의 아미노산으로 이루어져있다. Cathepsin B의 propeptide region 내에 GNFD motif와 occluding loop 가 존재함으로써 이것이 명백하게 cathepsin B group이라는 것을 보여주며, 계통 유전학적 분석 결과 다른 종의 cathepsin B에 비해 초창기에 분화되어 나온 것으로 사료된다. mature enzyme인 maPoCtB은 fusion protein인 glutathione S-transferase를 포함하는 pGEX-4T-1 vector에 삽입하여 E.coli 균주인 $DH5{\alpha}$ 내에 발현시켰다. 재조합 단백질인 PoCtB을 과발현 시킨 결과 53kDa의 분자량을 가진다. 넙치 cathepsin B 활성은 Z-Arg-Arg-AMC와 같은 fluorogenic 펩타이드 기질을 이용하여 측정되었고 적정 pH는 pH.7.5 이다.

• 미생물학회지
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• 제36권3호
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• pp.192-195
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• 2000

백색부후균류 laccase의 아미노 말단과 카복시 말단에 잘 보존된 구리결합부위를 암 호화하는 DNA 염기서열과 상보적인 primer를 이용하여 백색부후균의 일종인 영지버섯 Gandoderma lucidum에서 laccase 유전자 단편을 분리하였다. PCR 로 증폭하여 클로닝한 1.6 Kb DNA 절편의 염기 서열을 결정하여 분석하였다. 이 DNA에는 7개의 인트론이 존재 하였으며 엑손의 염기서열과 이로부터 추정된 아미노산 서열은 Tranmetes villosa laccase(lccl)와 각각 47%, 79% 동일하였다. 기타 다른 백색부후균류의 laccase 아미노산 서 열과는 66~78% 동일하였다.

• 생명과학회지
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• 제22권3호
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• pp.306-311
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• 2012

내냉성 세균인 Pseudomonas mandelii로부터 lipase 유전자(lipT)를 클로닝하고 염기서열을 분석하였다. 열린해독틀 (open reading frame)은 1,686 bp로 구성되어 있고, 562개의 아미노산을 코딩한다. 서열분석 결과 많은 세린 효소에서 발견되는 Gly-X-Ser-X-Gly 모티프가 존재한다(Gly-His-Ser-Leu-Gly). 재조합 LipT 단백질은 대장균에서 주로 inclusion body 형태로 발현되었다. 니켈 친화성 크로마토그라피 방법으로 LipT 단백질을 분리하였으며 소량의 LipT 단백질이 refold 되었다. 이 효소는 p-nitrophenyl butyrate (C4)과 p-nitrophenyl octanoate (C8)에 대해 기질 특이성을 나타내었다.

• 미생물과산업
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• 제14권1호
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• pp.22-28
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• 1988

DNA 클로닝과 조작기술의 발전은 어떤 유전자의 특정한 위치에 선택적으로 돌연변이를 도입할 수 있는 site-specific mutagenesis 기술을 창출해 내었다. 이 기술로 DAN 염기의 치환, 결실, 삽입등을 클론된 유전자에 직접 도입할 수가 있게 되어 생체의 유전자 조작이나 유전자의 산물인 단백질의 구조와 기능을 의도적으로 변화시키는 protein engineering에 광범위하게 이용되고 있다. Protein engineering은 주로 단백질의 촉매 및 생리활성의 증가, 효소의 특성및 기질 특이성의 변화, 단백질 구조의 안정화 및 내염성 증가, 분자량의 감소, 효소및 생리활성 단백질의 구조의 안정화및 내열성 증가 등에 활용되고 있으며 산업적 유용성이 큰새로운 단백질의 창조에도 기여할 것으로 기대를 모으고 있다. Site-specific mutagenesis 기술로 현재 가장 널리 이용되는 것이 in vitro상에서 수행하는 oligonucleotide-directed site specific mutagenesis이다. 이 방법은 생화학적으로 합성한 특정한 염기서열을 가진 oligonucleotide들을 일종의 mutagen으로 사용하거나 효소적 DNA 합성을 위한 primer로 사용하여 클론된 DNA의 염기서열을 선택적으로 개조하거나 혹은 다른 조작을 하는 것이다. 여기서는 돌연변이율을 높이는 여러가지 개량된 방법들이 나왔으며 그중의 몇가지를 소개하였다.

• 미생물학회지
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• 제30권1호
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• pp.8-14
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• 1992

Pseudomonas sp. DJ77로부터 extradiol dioxygenase 유전자(phnE)를 클로닝하고 염기배열을 결정하였다. 921 bp의 open reading frame (ORF) 이 존재하였고 개시코돈 앞에서 Shine-Dalgarno sequence를 발견하였다. phnE 유전자에서 만들어지는 PhnE 단백질은 분자량이 34,449 Da 인데 SDS-polycrylamide gel 전기영동에 의해 측정된 분자량과 일치하였다. PhnE는 NahH, XylE, DmpB 등과 아미노산 배열의 상동성의 약 50% 였다. DJ77에는 bphC와 같은 3형의 extradiol dioxygenase 유전자는 발견할 수 없었다. DJ77 과 JM101(pPE17)은 catechol, 3-methylcatechol, 4-methylcatechol, 2, 3-dihydroxybiphenyl 등의 기질을 meta-cleavage 하여 노란색 화합물을 생성할 수 있었다.

• 미생물학회지
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• 제33권4호
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• pp.232-236
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• 1997

Septin 유전자는 Saccharomyces cerevisiae에서 filament를 암호화하고 있으며 세포질분열이나 bud의 형성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져있다. S. cerevisiae에서 septin유전자는 4가지가 발견되었으며 초파리나 쥐의 세포에서도 발견되고 있다. 본 연구에서는 PCR 방법을 이용하여 Schizosaccharomyces pombe에서 septin 유전자를 찾아내었다. S. pombe의 septin 유전자는 1143 bp의 open reading frame을 갖고 있으며 380개의 아미노산으로된 42 kd의 분자량을 가진 단백질을 암호화하였다. S. cerevisiae의 septin 유전자의 하나인 $CDC_{12}$ 유전자와의 유사성을 비교한 결과 51.8%의 유사성이 있음이 밝혀졌다.

• 생명과학회지
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• 제18권12호
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• pp.1764-1770
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• 2008

이 연구의 목적은 생물공학적으로 이소프레노이드 생합성 유전자를 클로닝하여 이들을 형질전환시킨 대장균을 제조하여 이들을 숙주로 사용하여 아스타잔틴의 생산을 증가시키는 것이다. 본 연구진은 선행연구에서 Paracoccus haeundaensis로부터 아스타잔틴 생산에 관여하는 6개의 아스타잔틴 생합성 유전자군을 보고하였고, 이들 유전자들을 발현 벡타(pCR-XL-TOPO-Crt)에 재조합한 후 이 벡터를 대장균에 형질 전환시켜서 건조중량으로 400 ${\mu}g$/g의 아스타잔틴을 생산하였다. 아스타잔틴의 생산성을 증가시키기 위해서 대장균으로부터 이소프레노이드 생합성 경로에 관여하는 4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase (lytB), farnesyl diphosphate (FPP) synthase (ispA), isopentenyl (IPP) diphossphate isomerase (idi) 유전자들을 클로닝하였고, 이들 유전자를 (pCR-XL-TOPOCrt-full)와 같이 대장균에 각각 공발현시켰다. idi 유전자와 아스타잔틴 생산에 관여하는 아스타잔틴 생합성 유전자군이 함께 형질 전환된 BL21(DE3) Codon Plus RIL 대장균를 배양하였을때, 건조중량으로 1,200 ${\mu}g$/g의 아스타잔틴을 생산하였다. 따라서 본 연구 결과, 이소프레노이드 생합성 유전자와 아스타잔틴 생합성 유전자군을 공발현 시킬 때 아스타잔틴의 생산이 3배 증가하였다.

• 한국환경생태학회지
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• 제30권5호
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• pp.810-820
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• 2016

염생식물 퉁퉁마디의 종자 발아에 영향을 미치는 환경 요인을 조사하고 환경 스트레스에 의해 유도되는 2CysPrx 유전자를 클로닝한 후 스트레스 조건에 따른 2CysPrx 유전자의 발현 양상에 대하여 조사하였다. 염생식물에 대한 가장 대표적인 스트레스는 염분 스트레스로서 퉁퉁마디 발아에 중요한 요인으로 작용하고 있다. 퉁퉁마디의 발아에 대한 NaCl의 한계 농도는 7%로 나타났고, 최적의 발아 조건은 NaCl이 없는 상태로 확인되었다. 퉁퉁마디 발아에서 최적 온도는 $20^{\circ}C$로 98%의 발아율을 보였다. 스트레스에 유도되는 유전자 후보군 중 2CysPrx 유전자의 cDNA를 클론하여 분석한 결과 275개의 아미노산으로 이루어져 있고 두 개의 시스테인 잔기를 가지고 있으며 분자량은 30.1kDa으로 나타났다. 2CysPrx 유전자는 서던 블롯에 의해 유전체에 한 카피 존재하는 것으로 나타났고, 6개의 인트론과 7개의 엑손으로 구성되어 있다. qPCR에 의한 2CysPrx 유전자의 전사율을 분석한 결과, 3.5% NaCl과 40mM $H_2O_2$ 처리 조건에서 전사율이 가장 높게 나타났고, 고온($40^{\circ}C$)과 $75{\mu}M$ ABA 처리 조건에서는 처리 후 8시간에 최고의 전사율을 보였으며, 저온($4^{\circ}C$)에서는 유전자 발현이 일어나지 않는 것으로 나타났다. 우리는 여러 환경 스트레스에 의해 유도되는 다른 유전자의 클로닝을 시도하고 있다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제45권2호
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• pp.155-161
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• 2017

Paenibacillus woosongensis의 유전체 부분 염기서열로부터 유추된 xylanase 유전자를 PCR 증폭하여 클로닝하고 염기서열을 결정하였다. 클로닝된 xylanase 유전자는 xyn11B로 명명되었으며, 356 아미노산으로 구성된 단백질을 코드하는 1,071 뉴클레오티드로 이루어졌다. Xyn11B의 아미노산 배열을 분석한 결과 glycosyl hydrolase family 11에 속하는 xylanase와 상동성이 높은 활성영역과 탄수화물 결합영역을 포함하고 있는 다영역 효소로 확인되었다. SignalP4.1 server로부터 아미노 말단의 26개 잔기가 signal peptide로 예측되었다. DEAE-Sepharose와 Phenyl-Separose 컬럼 크로마토그래피 과정을 통해 xyn11B 유전자를 함유한 재조합 대장균의 균체 파쇄상등액으로부터 Xyn11B를 부분 정제하였다. 부분 정제된 Xyn11B의 반응특성을 조사한 결과 pH 6.5와 $50^{\circ}C$에서 최대 반응활성을 보였고 birchwood xylan이나 oat spelt xylan보다 arabinoxylan에 대한 활성이 높았으며 셀룰로스, 만난과 para-nitrophenyl-${\beta}$-xylopyranoside에 대해서는 분해활성이 없었다. Xyn11B의 활성은 $Ca^{2+}$과 $Mg^{2+}$에 의해서는 약간 증가한 반면에 $Cu^{2+}$, $Ni^{2+}$, $Fe^{3+}$, $Mn^{2+}$에 의해서는 크게 저해되었고 SDS에 의해서 완전히 저해되었다.