• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2003년도 학술발표대회 발표논문초록집
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• pp.84-84
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• 2003

많은 연구에서 돼지의 난포란 혹은 배아가 낮은 온도에 대해 민감한 것은 세포질 내에 함유된 지방구와 관련이 있다고 하였으며, 이런 세포질내의 지방구를 제거함으로 동결능력이 향상된다고 하였다. 이렇게 지방구가 제거된 돼지의 난포란과 배아를 효과적으로 동결보존하기 위해서는 새로운 개념의 동결보존 기술이 필요하다고 하겠다. 따라서, 본 연구는 미성숙 단계에서 지방이 제거된 돼지 난포란의 유리화 동결에 적합한 방법을 찾기 위하여 straw를 이용한 유리화 동결법과 electron microscopic grid(EM grid)를 사용한 유리화 동결법을 실시하여 효율적인 동결방법을 검토하였다.

• Clinical and Experimental Reproductive Medicine
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• 제37권4호
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• pp.307-319
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• 2010

목적: 유리화 동결액의 조성조절과 냉각속도 증진을 통한 동결보호제의 농도를 낮추는 전략을 통해 세포에 미치는 독성을 감소시켜 유리화 동결 및 융해 후 생쥐 배아의 생존율 및 발생률을 증진시키고, 궁극적으로 배아의 유리화 동결법을 개선하고자 하였다. 연구방법: 생쥐 배아와 포배기를 그리드를 이용한 유리화 동결법을 이용하여 동결/융해하였다. 동결액 내 ethylene glycol와 dimethylsulphoxide (DMSO)의 농도와 당의 농도를 조절하여 생쥐 배아의 융해 후 생존율과 발생률을 관찰하였고, 냉각속도의 증가와 동결억제제의 농도와의 상관관계를 포배기의 융해 후 생존율과 발생률에 따라 비교하였다. 또한 융해 후 배아를 대리모에 이식하여 산자를 생산함으로 냉각속도의 효율성을 알아보았다. 결과: EG를 단독으로 사용한 동결보존액 보다는 DMSO와 혼합된 동결보존액의 사용이 보다 유리하다는 결과를 얻을 수 있었다. 슬러시 질소에 의한 냉각속도의 증가가 동결보존의 대상의 상해를 줄여 유리화 동결의 효율성을 증진시키는 것으로 생각된다. 결론: 혼합된 동결보호제를 사용하였을 때 생쥐 배아의 유리화 동결 후 생존과 발생률이 증진되었다. 슬러시 질소를 이용한 유리화 동결의 도입은 냉각속도의 증가를 통해 기존 유리화 동결방법의 효율을 증진시켜 생존율과 융해후 발생률, 임신율 증진에 기여하였다. 또한 냉각속도의 증진은 유리화 동결의 필수요건인 고농도의 동결억제제에 대한 노출을 감소시킬 수 있었다. 이러한 노력은 생식력의 보전을 위한 유리화 동결법의 효율 향상에 기여할 것이다.

• 한국수정란이식학회지
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• 제21권1호
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• pp.53-58
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• 2006

본 연구는 마우스의 성숙 난자와 수정란의 유리화 동결을 위한 CPS, 기존 straw 및 OPS 방법의 효과에 대하여 비교하였다. 마우스 난자의 유리화 동결-응해 후 형태학적인 생존율을 조사한 결과, CPS (75%)와 기존 straw(72%)법이 OPS(68%)법에 비해 유의적으로 높은 생존율을 나타내었다(p<0.05). 과배란 처리 후 채란한 2-세포기 마우스 수정란을 유리화 동결-응해하여 $3{\sim}5$일간 배양한 다음 수정란의 배 발달 상태를 비교한 결과, 동결하지 않은 대조군(56%)과 CPS법(48.6%)의 배반포 발달률이 기존 straw법(43.4%)과 OPS법(37.7%)보다 유의적으로 높았다(p<0.05). Morula 형성률도 비동결 대조군, CPS, 기존 straw, OPS 순으로 낮아졌다. 이러한 결과는 CPS에 의한 유리화 동결법이 기존 straw와 OPS에 비하여 높은 생존성과 안전한 보존성 유지에 유리하다고 본다.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2003년도 학술발표대회 발표논문초록집
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• pp.83-83
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• 2003

돼지 난자의 유리화 동결 처리 방법 중 난자를 담는 용기(loading vessel)의 재료로 최근에 알려진 것으로 open-pulled straws(OPS)[Vajta등, Mol Reprod Dev, 51:53-58, (1998)], electron microscope grids(EMG) [Martino등,Biol Reprod, 54:1059-1069, (1996)〕, nylon loop system(NLS) [Lane등, Fertil Steril,72: 1073-1078, (1999)] 등이 보고되고 있다. OPS는 1/4cc straws를 열을 가하여 길게 뽑아 내벽을 얇게 함으로써 filing된 난자나 수정란이 액체 질소와 접촉했을 때 유리화가 신속하게 되도록 하는 방법으로 돼지에서는 별로 보고된 것이 없다. EMG는 열전도가 예민한 전자현미경용 copper grid를 이용한 방법으로 최근 국내 기술진의 연구성적을 포함한 몇몇 학자들에 의하여 보고되었고 NLS는 0.5mm직경의 nylon loop를 이용하여 급속 동결한 성적이 보고되었으나, 돼지 난자에 응용 된 것은 없다. 따라서 이와 같은 동결 재료는 사람과 반추류, mouse외에 돼지 난자에 대하여는 전혀 시도되지 않았지만 유리화 동결기술에서 가장 중요한 실험으로 생각된다. 성공적인 유리화 동결을 위해서는 수정란이 냉각의 전도성이 빠르고, 작은 용액을 수정란과 같이 filling해야 하며 모든 동작이 신속 간편해야 하며 융해 방법도 초급속도의 융해가 요구되므로 이에 부합되어야 한다. 연구 목적은 돼지 난자를 유리화 동결/융해 시 동결 재료-straw/glass, copper grid, nylon 3가지에 대한 제작 방법, 난자 loading, 동결 처리, 보관 방법, 융해 방법 등을 난자의 회수, 수정 후 생존율을 비교 조사하여 가장 우수한 방법을 선택할 목적이었다. 수행 내용은 3가지의 재료의 sample을 제작하고 소독한 다음 준비된 돼지 COCs을 40시간동안 IVM한 후 난자를 5~l5개 정도로 선정 하여 준비된 VS 용액에 평형처리 하였다. 각 재료의 용기에 loading 한 후 동결/보관하였고, 융해는 역순으로 평형하여 maturation 배지에 3~4시간 배양한 다음 경검하고 IVF한 후 NCSU-23 배지에 담아 IVC 배양하면서 cell cleavage상태를 확인하였다.

• 한국가축번식학회지
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• 제25권3호
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• pp.287-292
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• 2001

난자의 동결보존 방법은 보다 효과적 난자은행을 개발하기 위한 필수불가결한 요소이다. 본 연구에서는 보다 효과적인 유리화 동결법을 개발하기 위해 유리화 동결 응해 후 염색체와 방추사의 손상이 일어나는지를 알아보고자 본 실험을 수행하였다. 난구세포에 둘러싸인 난자를 5.5 M etylene glycol과 1.0 M sucrose 용액에 노출 후 electron microscope grid에 부착시킨 후 액체질소에서 냉동 보존하였다. 동결 융해 후 생존한 난자들은 방추사의 이상성을 보기 위해 immunostaining 방법을, 염색체의 이상성을 보기 위해 karyotyping을 시행하였다. 실험결과 염색체 이상빈도는 대조군의 경우 19.6%, 동결 융해군은 32.8%로 관찰되었고, 방추사의 이상빈도는 대조군의 경우 20.2%, 동결 융해군의 경우 32.3%로 대조군에 비해 염색체와 방추사의 이상성이 증가되었다. 결론적으로 마우스의 성숙난자를 유리화 동결시킨 후 염색체와 방추사의 이상성이 증가됨을 관찰하였다.

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2001년도 춘계학술발표대회
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• pp.75-75
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• 2001

유리화 동결법은 동결중 ice crystal의 형성이 이루어지지 않으므로 난자의 동결보존을 위한 유용한 동결방법이다. 이전의 연구에서 마우스의 난자를 ethylene glycol과 electron microscope grid를 이용한 유리화 동결법으로 동결 융해한 결과 기존의 slow freezing 방법에서보다 높은 생존율과 배발달율이 나타남을 관찰하였다. 그러나 동물과 인간 난자를 이용한 연구를 통하여 난자의 경우 동결 융해후 염색체에 부착되어 있는 미세소관인 방추사가 온도의 변화에 매우 민감하여 염색체 이상성이 증가되는 것이 보고되었다. 이에 본 연구에서는 성숙난자를 유리화동결법에 의해 동결 융해후 난자의 염색체와 방추사의 이상성이 증가되는지 알아보고자 본 실험을 수행하였다. ICR mouse의 성숙란을 채취하여 연구목적에 따라 fresh한 대조군과 동결음해 시킨 실험군으로 분류하였다. 동결방법은 난자를 1.5 M ethylene glycol (EG)에 2분 30초간 노출 시킨후 5.5 M EG와 1M sucrose가 첨가된 동결액에 20초간 노출시킨 후 Grid에 난자를 부착시킨 후 직접 액체질소에 침지하여 동결하였다. 동결후 난자는 5단계로 융해를 실시한 후 생존된 난자는 tubulin 항체를 이용한 immunostaining 방법으로 방추사의 이상성을 관찰하였고, 염색체는 난자를 고정 후 10% Giemza로 염색 후 염색체의 수적인 이상성을 관찰하였다. 염색체 분석결과 염색체 이상 빈도는 대조군의 경우 19.6%, 동결융해군은 32.8%로 관찰되었다. 또 방추사의 이상빈도는 대조군의 경우 20.2%, 동결 융해군은 32.3%로 관찰되어 동결 융해후의 난자에서 염색체와 방추사의 이상 빈도가 증가됨이 관찰되었다.찰되었다. 배아이식후 대조군과 실험군에서 각각 2 마리가 임신이되어 정상적인 산자를 분만하였다. 따라서 항동해제에 taxol의 첨가는 동결 융해후의 난자의 배발달율을 증진시킬 수 있었다..8%로 나타나 난할율 및 배반포 발생율에 있어서 융합조건에 따라 큰 차이는 없었으나 1.9㎸/cm, 30$\mu\textrm{s}$ 2회의 조건이 다른 조건들에 비하여 유의적으로 낮았다. 따라서, 체세포와 수핵란 세포질간의 융합율과 배반포 발생에 미치는 영향은 전압보다는 시간에 더 크게 받음을 알 수 있었으며, 이와 같은 결과에서 융합시 시간을 오래 주는 것보다 전압을 높이는 것이 수핵난자의 세포질에 상해를 줄이고 이후 배반포 발생에 유리할 것으로 사료되었다.면에서도 더욱 더 활발할 것으로 기대된다. 배란후 72시간째에 초음파진단기를 이용하여 난소의 난포발달을 조사한 결과 , 대조구와 bFF처리구에 비해 AI처리구에서 발달난포가 유의적으로 많은 것을 확인하였다. 이상과 같은 결과로, Anti-inhibin serum은 한우 자체에서 분비하는 Inhibin을 특이하게 억제하여 Inhibin에 의해 억제되는 FSH분비가 촉진됨으로써 난포발달과 estrogen의 농도가 촉진되는 것으로 사료되어 anti-inhibin serum이 한우의 과배란유기 효과가 있는 것으로 사료된다.정량 분석한 결과이다. 시편의 조성은 33.6 at% U, 66.4 at% O의 결과를 얻었다. 산화물 핵연료의 표면 관찰 및 정량 분석 시험시 시편 표면을 전도성 물질로 증착시키지 않고, Silver Paint 에 시편을 접착하는 방법으로도 만족한 시험 결과를 얻을 수 있었다.째, 회복기 중에 일어나는 입자들의 유입은 자기폭풍의 지속시간을 연장시키는 경향을 보이며

• 한국동물번식학회:학술대회논문집
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• 한국동물번식학회 2001년도 춘계학술발표대회
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• pp.74-74
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• 2001

난자 동결방법의 선별은 보다 효과적인 난자은행의 개발에 필수 불가결한 중요한 요소이다. 이전의 연구에서 마우스의 난자를 ethylene glycol과 electron microscope grid를 이용한 유리화 동결법으로 동결 융해한 결과 기존의 slow freezing 방법에서보다 높은 생존율과 배발달율이 나타남을 관찰하였다. 그러나 동결융해후의 난자는 방추사와 염색체의 이상성이 대조군에 비해 높은 빈도로 나타나 융해후의 배발달율을 감소시키는 것으로 보고되었다. 이에 본 연구에서는 유리화동결법동안 항동해제에 Cytoskeleton system을 안정화시키는 cytoskeleton stabilizer인 taxol을 첨가시킨후 동결시켰을때 생존율과 발달율을 개선시킬 수 있는지 알아보고자 본 실험을 시행하였다. ICR mouse의 성숙란을 채취하여 연구목적에 따라 taxol을 첨가시키지 않은 대조군과 첨가시킨 실험군으로 분류하였다. 동결방법은 난자를 1.5 M ethylene glycol (EG)에 2분 30초간 노출시킨후 5.5 M EG와 1 M sucrose가 첨가된 동결액에 20초간 노출시킨 후 Grid에 난자를 부착시킨후 직접 액체질소에 침지하여 동결하였다. 동결후 난자는 5단계로 융해를 실시한 후 정자와 체외수정을 시킨 후 수정된 난자는 modified P1 배약액에 124 h까지 발달율을 관찰하였고, 배양 후 발달된 배반포는 대조군과 실험군, 각각 4마리의 발정동기화된 recipient에 이식을 시행하였다. 배발달율은 대조군에 비해 실험군에서 4세포기 (48 vs. 84.4%), 8세포기 (34% vs. 70.6%), 상실배 (26% vs. 58.6%) 그리고 배반포 발달율은 (24% vs. 58.6%)로 높게 관찰되었다. 배아이식후 대조군과 실험군에서 각각 2 마리가 임신이되어 정상적인 산자를 분만하였다. 따라서 항동해제에 taxol의 첨가는 동결 융해후의 난자의 배발달율을 증진시킬 수 있었다..8%로 나타나 난할율 및 배반포 발생율에 있어서 융합조건에 따라 큰 차이는 없었으나 1.9㎸/cm, 30$\mu\textrm{s}$ 2회의 조건이 다른 조건들에 비하여 유의적으로 낮았다. 따라서, 체세포와 수핵란 세포질간의 융합율과 배반포 발생에 미치는 영향은 전압보다는 시간에 더 크게 받음을 알 수 있었으며, 이와 같은 결과에서 융합시 시간을 오래 주는 것보다 전압을 높이는 것이 수핵난자의 세포질에 상해를 줄이고 이후 배반포 발생에 유리할 것으로 사료되었다.면에서도 더욱 더 활발할 것으로 기대된다. 배란후 72시간째에 초음파진단기를 이용하여 난소의 난포발달을 조사한 결과 , 대조구와 bFF처리구에 비해 AI처리구에서 발달난포가 유의적으로 많은 것을 확인하였다. 이상과 같은 결과로, Anti-inhibin serum은 한우 자체에서 분비하는 Inhibin을 특이하게 억제하여 Inhibin에 의해 억제되는 FSH분비가 촉진됨으로써 난포발달과 estrogen의 농도가 촉진되는 것으로 사료되어 anti-inhibin serum이 한우의 과배란유기 효과가 있는 것으로 사료된다.정량 분석한 결과이다. 시편의 조성은 33.6 at% U, 66.4 at% O의 결과를 얻었다. 산화물 핵연료의 표면 관찰 및 정량 분석 시험시 시편 표면을 전도성 물질로 증착시키지 않고, Silver Paint 에 시편을 접착하는 방법으로도 만족한 시험 결과를 얻을 수 있었다.째, 회복기 중에 일어나는 입자들의 유입은 자기폭풍의 지속시간을 연장시키는 경향을 보이며 큰 자기폭풍일수록 현저했다. 주상에서 관측된 이러한 특성은 서브스톰 확장기 활동이 자기폭풍의 발달과 밀접한 관계가 있음을 시사한다.se that were all low in two aspects, named "the Nonsignificant group". And the issues were high risk perception in general setting and

• 한국가축번식학회지
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• 제15권1호
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• pp.49-57
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• 1991

생쥐 수정란의 동결보존법을 개선하고자 유리화 동결과정에서 제1보존액에서의 평형시간, 제2보존액에서의 전냉각 여부 및 straw loading 방법에 따른 동결보존 후 수정란의 생존율을 조사하고, 또한 유리화 동결보존 과정에서 수정란의 부분적인 손상 여부를 확인하기 위하여 동결보존 후 배양하여 수정란의 할구수를 Hoechst 33342로 염색하여 조사하였던 바 그 결과는 다음과 같다. 1. 동결융해 후 생존율은 Medium-1에서 10분간 평형시간을 준 경우(81.0%)는 5분간(40.0%) 및 15분간(74.1%)의 평형시간을 준 경우보다 유의적(P<0.05)으로 높았다. 2. Double Medium-2 column방법으로 얻은 생존율(81.0%)은 single Medium-2 column방법으로 얻은 생존율(62.8%)보다 유의적(P<0.01)으로 높았다. 그리고 Double Medium-2 column방법에서는 유리화 용액이 희석액에 오염되지 않아 순수하게 투명한 유리화를 이룰 수 있었다. 3. 전냉각을 않은 경우에 비하여 전냉각한 Medium-2로 동결한 수정란은 생존율에 있어서 다소 높은 성적을 보였으나 유의적인 효과는 없었다. 4. 상실배기의 수정란을 24~28시간동안 배양하여 얻은 후기 배반포를 Hoechst 33342로 염색하여 할구수를 조사하였던 바 신선란(53.3${\pm}$1.6)보다 동결란(41.4${\pm}$1.5)에서 유의적(P<0.05)으로할구수가 적었다. 이는 동결융해 과정에서의 부분적인 손상에 의하였던 것으로 사료된다.

• 한국가축번식학회지
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• 제23권1호
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• pp.75-84
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• 1999

본 연구는 토끼 전핵배의 효율적인 생산을 위한 동결방법과 조건 등을 찾고자 유리화 동결 및 완만동결법으로 동결ㆍ융해 후 체외배양하여 생존율 및 발달률을 조사하였다. 과배란시킨 토끼의 난관으로부터 채란된 전핵배를 동결에 공시하였다. 유리화 동결은 동결보호제로 EFS 와 EPG-I을 완만동결시는 EPG-II를 사용하였다. 동결ㆍ융해 후 5%, 39$^{\circ}C$ $CO_2$incubator 에서 소 난관상피세포와 공배양하였다. 본 실험의 결과는 다음과 같다. 동결보존을 위하여 동결보호제에 적절한 평형시간과 독성 여부를 판단하기 위하여 전핵배를 EFS 용액에 0~5분간 평형시킨 후 부화배반포로의 발달률은 1 분 군에서 72.0%로 동결보호제에 노출시키지 않은 대조구 (84.1%)에 비하여 무해한 결과를 얻었으나, 그 이상에서는 유해한 결과를 보여 주었다. EFS 노출 후 희석제로 sucrose와 D-PBS를, sucrose 사용 없이 D-PBS 만으로 희석하였을 때 유의적인 (P＜0.05) 차이를 보이지 않았다. 동결보호제에 있어서는 독성검사 및 동결ㆍ융해 후 발달률을 보아 EFS, EPG-. EPG-II는 동결보존에 있어서 동결보호제로서의 가능성을 보여주었으며 서로간의 유의적인 (P＜0.05) 차이는 찾아볼 수 없었다. 유리화동결에 의한 전핵배의 부화배반포로 발달률은 6.1%를 나타내었고, 완만동결에 의한 부화배반포 발달률은 11.5%로서 동결방법간에는 유의적인 (P＜0.05) 차이가 없었다. 완만동결시 동결속도가 전핵배의 투명대 파열에 미치는 영향을 규명하기 위하여 동결속도 및 침지온도를 달리하여 조사하였을 때 －35$^{\circ}C$ (25%) 보다는 －85$^{\circ}C$ 0.9%) 에서 액체질소에 침지하였을 때가 투명대 파열률에 있어 유의적인 (P＜0.05) 차이를 보였다. 이상의 결과로부터 전핵배는 현 배양상태에서 유리화동결 및 완만동결에 의하여 동결보존이 가능하다고 사료되나 전핵배의 배반포로의 발달률은 다소 저조하였다. 유리화동결 및 완만동결에 의한 전핵배는 후기 단계의 수정란보다 물리적, 화학적 손상에 더욱 민감하여 생존율 및 발달률에 영향을 미친다고 사료된다.

• 한국수정란이식학회:학술대회논문집
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• 한국수정란이식학회 1997년도 추계학술대회 및 워크숍
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• pp.50-50
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• 1997