잿빛곰팡이병의 전형적인 병징을 나타내는 병든 사과, 고추, 딸기, 오이, 토마토에서 곰팡이를 분리하고, 그들의 배양학적 특성과, 형태적 특성 및 PCR-RFLP을 통해 이 병원성 곰팡이를 모두 Botrytis cinerea로 동정하였다. 또한, 배양학적 특징에 따라 사과, 고추, 오이에서 분리한 잿빛곰팡이병균의 표현형은 균핵형이며, 딸기와 토마토에서 분리한 잿빛곰팡이병균은 균사형이었다. 각각의 잿빛곰팡이병균의 ITS 영역 염기서열을 포함한 4종의 유전자(RPB2, HSP60, G3PDH)의 염기서열을 결정하고 분자계통학적 유연관계를 분석하였다. RPB2 유전자 염기서열을 제외한 ITS 영역, HSP60유전자 및 G3PDH 유전자의 염기서열은 Botrytis cinerea 종 내 뿐만 아니라 Botrytis 속 종간에도 매우 높은 상동성을 나타내어 계통학적 유연관계 분석이 어려웠다. 하지만, 3종의 유전자(RPB2, HSP60, G3PDH)를 결합한 유전자 염기서열을 이용한 분자계통수 작성 결과, 본 연구에서 분리한 잿빛곰팡이병균은 Botrytis 속의 다른 종들과 구별되며, 사과, 고추, 오이, 토마토의 분리주는 아주 높은 근연관계에 있고, 딸기잿빛곰팡이병균은 다른 분리주와 달리 종내 다른 lineage를 형성하였다.
대전, 공주, 논산, 부여와 김해 등에서 병든 딸기, 토마토, 오이에서 총 992균주의 잿빛곰팡이병균을 분리하여 이들 균주로부터 dichlofluanid 저항성 5균주, 감수성 5균주를 임의로 선발하였다. 분리된 균의 dichlofluanid 저항성을 조사한 결과 105균주(10.6%)가 저항성이었다. 저항성균 균사의 최소 억제 농도(minimum inhibitory concentration)는 100~500$\mu\textrm{g}$/ml 이상이었으나 감수성균은 10 $\mu\textrm{g}$/ml 미만이었다. Dichlofluanid 저항성의 안정성 조사를 위하여 35$^{\circ}C$고온 처리 및 계대 배양할 때 조사된 저항성 5균주 중 3균주는 저항성이 감소하거나 상실되었다. 저온 저장 및 온실에 장기 보관할 때는 조사된 저항성 균주 모두가 저항성이 감소하거나 완전히 상실되는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 이 약제에 대한 저항성이 불안정하다는 것을 나타낸다. 오이에 감수성균 및 저항성균을 혼합 접종한 후 재분리할 때 시간이 지날수록 감수성균이 더 많이 분리되어 저항성균의 경합 능력이 감수성 균주에 비하여 열등하였다.
1994~1995년 사이에 대전, 공주, 논산, 부여와 김해 등지에서 채집한 병든 딸기, 토마토, 오이에서 총 1,504 균주의 잿빛곰팡이병균을 분리하여 10 $\mu\textrm{g}$/ml의 약제를 넣은 PDA 배지에서 배양하면서 약제반응을 조사한 결과, benomyl에 대하여는 1,147(76.3%)균주, procymidone에 대하여는 614(40.8%)균주, prochloraz에 대하여는 189(12.6%)균주가 저항성으로 나타났다. UV 처리 및 약제 배지에서의 누대배양을 통하여 prochloraz저항성 균주를 선발하였는데, 이들의 생육 억제 최소 농도(MIC)는 8 $\mu\textrm{g}$/ml 이상이었고, 감수성균의 MIC는 2 $\mu\textrm{g}$/ml 이하였다. 병원력, 포자 발아율, 균핵형성과 같은 적응력과 관련된 생물학적 특성 비교에서 저항성 균주들은 감수성 균주보다 열등하거나 비슷한 정도로 나타났다.
항균균활성이 있는 4-isopropylphenol(I)과 2-isopropylphenol (II)을 출발물질로 하여 ester, sulfonyl ester, phosphoyl ester와 ether계열 유도체 42종을 합성하였으며, 확인은 IR, $^{1}H-NMR$과 GC/MS를 이용하였다. 이들 유도체들에 대한 in vitro 항균활성 실험을 오이탄저병균(Colletotrichum orbiculare) 외 9종에 대하여 실시하였다. 그 결과, 2-isopropylphenyl piperonyloate(II-7a)가 오이탄저병균(Colletotrichum orbiculare)과 토마토잎마름병균(Phytophthora infestans)에 효과가 있었으며, 4-isopropylphenyl bromoacetate(I-3a)가 오이잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea), 4-isopropylphenyl-4-methoxybenzenesulfonate(I-6b)는 벼도열병균(Pycularia oryzae)에 탁월한 효과를 나타내었으며, 4-isopropylphenylbenzyl ether(I-4d)가 오이탄저병균(Colletotrichum orbiculare)에 우수한 효과를 나타내었다. In vivo 실험에서는 2-isopropylphenyl piperonyloate(II-7a)가 오이탄저병(Colletotrichum orbiculare)과 토마토잎마름병(Phytophthora infestans), 4-isopropylphenyl 4-methoxybenzenesulfonate(I-6b)가 벼도열병(Pycularia oryzae)에 매우 우수한 항균활성을 나타내었다.
Strobilurin계 살균제인 azoxystrobin에 대한 잿빛곰팡이병균 Botrytis cinerea의 저항성 발현 여부를 조사하였다. B. cinerea 균주는 $1.0{\mu}g\;mL^{-1}$의 azoxystrobin에 대한 반응을 기준으로 실험 균주 중에서 46.5%가 감수성 균주로, 53.5%가 저항성 균주로 판명되었다. 병원균을 분리한 지역별로 저항성 균주의 출현 비율은 경기, 경남, 부산에서 28.6, 41.9, 36.8%이었으며, 충남에서 81.1%로 다른 지역보다 높게 나타났다. 기주별로 저항성 균주는 딸기, 오이, 토마토에서 분리한 균주에서는 각각 68.0, 40.0, 50.0%, 고추에서는 9.1%만이 나타났다. Azoxystrobin에 대해서 감수성이었던 B. cinerea 11-20은 kresoxim-methyl과 trifloxystrobin에 대해서도 감수성 반응을 보였으며, 저항성 균주인 11-74는 3종의 살균제 모두에 대해서 교차 저항성이 있음을 보여 주었다. 본 실험의 결과 실험에 사용한 B. cinerea 균주의 53.5%가 저항성 반응을 보일 정도로 높은 저항성 출현율을 보였으며, 동일 계열의 살균제에 대한 교차 저항성 반응을 보이고 있기 때문에, 포장에서 strobilurin계 살균제에 대한 철저한 관리가 요구되어진다.
잿빛곰팡이병균(Botrytis cinerea) 51균주를 국내 여러곳에서 분리 또는 확보하여 이들 균주의 기주, 형태적 특성, 약제저항성 및 polygalacturonase 활성을 조사하였으며, 분리 기주별로 병원성을 포함한 이들 특성의 상호관계를 조사하였다. 분리된 균주들은 모두 흰색, 엷은 회색 또는 짙은 회색의 균총색을 보였고, 균주에 따라 균핵과 포자형성량이 달랐다. 병원성 검정에서는 토마토, 오이, 딸기로부터 분리된 균주들의 오이잎 괴사병반 지름이 평균 3.2 cm로 감귤, 양다래, 배 등 다른 기주로부터 분리된 균주의 1.8 cm보다 훨씬 컸다. 각 균주들의 살균제 저항성은 토마토 분리균주들의 benomyl 저항성이 $EC_{50}$ 562 ppm으로 다른 균주에 비해 훨씬 높았으며, 딸기 분리균주의 경우 사용된지 얼마되지 않은 diethofencarb에 대하여 $EC_{50}$ 210 ppm으로 높은 저항성을 나타내었다. Polygalacturonase 활성은 균주간에 변이가 심하여 specific activity가 최저 0 unit부터 103 unit까지 걸쳐 있었으며, 토마토, 오이, 딸기 등 주요 기주로부터 분리된 균주가 그렇지 않은 균주에 비해 약간 낮은 경향을 보였다. 균주들의 효소활성, 살균제 저항성과 병원성간에는 직접적인 상관관계가 없었다. 그러나, 병원성이 강한 균주와 약한 균주의 polygalacturonase 동위효소 pattern은 배양시 탄소원에 따라 서로 약간의 차이가 있었다.
토마토의 엽권에서 분리한 Fusariym graminearum이 분비하는 물질은 벼 도열병균(Pyricularia oryzae)의 여러 종의 식물병원 진균에 대한 항균활성을 나타내었으며, 이러한 활성물질을 PDA에서 본 균을 배양 한 후 chloroform으로 추출하여 분리정제 하였다. HPLC에 의하여 5종류의 활성 물질을 분획하였으며, 그중 1번(F402) 화합물을 벼 도열병균(P. oryzae)을 포함한 22개 식물 병원 진균에 대하여 살균 활성범위를 조사한 결과, 이 화합물은 50$\mu\textrm{g}$/ml 농도에서 Pythium ultimum, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum은 전혀 억제하지 못하였으며, Phytophthora spp., Cladosporium fulvum, Fusarium spp., Corynespora cassicola에는 어느 정도의 활성이 있었지만 낮게 나타났고, P. oryzae, Cochliobolus miyabeanus, Alternaria solani는 100% 억제하여 활성이 높게 나타났다. 또한 장내 세균에 대한 활성을 MIC로 비교할 때 Streptococcus pyogenes, Streptococcus faecium에 대하여는 각각 12.5, 25 $\mu\textrm{g}$/ml였고 Staphylococcus aureus는 25-50$\mu\textrm{g}$/ml으로 나타났으며, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Klebsiella aerogenes, Enterobacter cloacae에서는 100$\mu\textrm{g}$/ml 이상으로 활성이 나타나지 않았다. F402를 200$\mu\textrm{g}$/ml의 농도로 직접 살포한 식물체에서의 방제효과는 벼도열병, 벼 깨씨무늬병, 보리 흰 가루병에 대하여는 80%이상이었으나, 벼 잎집무늬마름병, 오이 잿빛곰팡이병, 토마토 역병, 밀 녹병에서는 낮았다.
병든 오이, 토마토, 딸기로부터 분리한 Botrytis cinerea을 Paul(1928)의 형태형(morphological phenotypes) 분류 기준에 따라 포자형, 균핵형, 균사형으로 나눌 때 대부분의 균주는 균핵형으로 나타났다. Benzimidazole 및 dicarboximide계 살균제에 대한 감수성 및 저항성 반응 차이는 형태형과는 무관하였다. 포자의 표면 구조를 주사형 전자현미경으로 관찰한 결과 모두 봉상으로 형태형 간에 차이가 없었다. 형태형 간 병원성을 비교할 때, 균사형의 균주가 가장 병원성이 높았으며, 포자형은 병원성이 다른 형보다 낮게 나타났다. 병원성과 곰팡이의 phenol oxidase, pectin methyl esterases (PME), amylases, cellulases, ureases, glucosidases 및 proteinases 활성과의 관계를 조사하기 위하여 형태형이 다른 선발된 균주들의 효소 활성을 조사한 결과, Phenol oxidase, ${\beta}-glucosidase$는 각 형태형 간에 차이가 없었으나, PME, amylase, cellulase, urease, proteinase의 활성은 각 형태형간에 차이를 나타내어 병원성과 이들 효소 활성의 관련성이 있었다.
항균활성을 나타내는 thyme oil의 주성분인 thymol(I)과 carvacrol(II)을 출발물질로 하여 ester, sulfonyl ester, carbamate, ether와 phosphoyl ester 계열 유도체 41종을 합성하였다. IR, GC/MS 와 $^1H$-NMR spectrum을 이용하여 합성된 화합물들을 확인하였다. 이들 유도체들을 10종의 식물 병원균에 대하여 항균활성 실험을 실시한 결과 몇가지 화합물이 우수한 항균활성을 나타내었다. 이들 화합물에 대한 in vivo실험은 오이, 토마토와 벼 작물에서 실시하였다. 그 결과, 2-isopropyl-5-methylphenyl acetate(I-1a)가 오이 잿빛곰팡이 병균(Botrytis cinerea)과 벼도열병균(Pyrcularia oryzae)에 높은 항균활성을 나타내었으며, methyl(2-isopropyl-5-methylphenoxy)acetate(I-6d)는 벼 잎집무늬마름병균(Rhizoctonia solani)에서 ethyl4-(2-methyl5-isopropylphenoxy)-crotonate(I-7d)는 토마토역병균(Phytophthora infestans)에서 우수한 항균활성을 나타내었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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