• 생명과학회지
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• 제18권11호
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• pp.1592-1599
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• 2008

$\beta$-Lactam계 항생물질에 강한 내성을 가지는 균주 Bacillus sp. J105가 생산하는 $\beta$-lactamase의 유전자를 E. coli DH5$\alpha$에 cloning하였다. Cosmid vector pLAFR3을 이용하여, Sau3AI 으로 부분 분해한 chromosomal DNA와 BamHI으로 처리한 pLAFR3을 ligation하였다. In vitro packaging kit를 사용하여 E. coli에 형질도입 하였으며 $\beta$-lactamase양성 clone주를 획득하였다. 이 recombinant plasmid ($\beta$-lac+)를 pACYC184 (4.2kb) vector를 사용하여 subcloning 하여 최종 $\beta$-lactamase의 활성이 있는 6.4 kb 단편이 포함된 pKL11${\Delta}4.6$을 제작하였다. 이 단편을 DNA 염기서열을 분석한 결과 309개의 아미노산으로 구성된 $\beta$-lactamase를 코딩하는 927 bp를 포함하고 있었다. 클로닝된 $\beta$-lactamase 유전자의 upstream을 포함하는 170 bp의 염기서열을 분석한 결과, B. thuringinesis와 B. cereus 유래의 $\beta$-lactamase 유전자의 upstream 부위와 97%의 일치를 보였다. 본 연구에서 클로닝된 $\beta$-lactamase의 아미노산을 서열을 NCBI BLAST program을 이용하여 분석해 본 결과 B. thuringinesis와 B. cereus의 $\beta$-lactamase와 각각 97%와 94%의 일치를 보였다. 또한 계통도 분석 결과 역시 본 연구에서 클로닝된 $\beta$-lactamase의 아미노산을 서열은 B. thuringinesis와 B. cereus 와 유전학적으로 아주 밀접한 관계를 보여주었다. 이 pKL11-${\Delta}4.6$를 E. coli에서 형질전환 시켜 발현 양상을 조사해 본 결과 $\beta$-lactamase의 secretion efficiency는 약 $4{\sim}5%$％였다. E. coli의 세포 내 단백질로부터 $\beta$-lactamase를 정제하여 분자량을 확인한 결과 31 kDa로 wild type의 분자량과 일치함을 확인하였다.

• 원예과학기술지
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• 제28권5호
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• pp.828-835
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• 2010

사과 품종을 구분하는 일반적인 방법은 형태적인 특성 평가를 근거로 하지만 유전적으로 밀접하게 연관되어 있는 품종들은 형태적 형질에 의해 품종을 구별하기는 불가능하다. 본 연구는 사과 국내 육성 품종을 정확히 판별할 수 있는 DNA 마커를 개발하고자 수행하였다. 국내육성과 도입 사과 31품종으로부터 30종의 임의 프라이머를 이용한 RAPD 분석을 통해 품종 간 다형성을 나타내는 마커 83종을 얻었다. SCAR 마커로 전환하기 위해 52종의 RAPD 단편들을 클로닝 및 염기서열 분석을 하였고 이들 중에서 17종의 SCAR 마커가 클로닝된 RAPD 단편과 동일한 크기의 단일 밴드가 증폭되었다. SCAR 마커 중 6종(AN11_433, AN08_566, A408_592, AK17_653, AO04_711, AO04_779와 AW15_368, AN11_433, A408_592, AK17_653, AO04_711, AO04_779, 또 는 AL1_427, AN11_433, AN08_566, A408_592, AK17_653, AO04_779) 또는 7종의(AL1_427, AN11_433, AN08_566, A408_592, AK17_653, AM16_708, AO04_779와 A330_424, AN11_433, AG14_502, AN08_566, A408_592, AK17_653, AO04_779 또는 A330_424, AN11_433, AK14_564, A408_592, AK17_653, AM16_708, AT14_789) 조합을 이용하여 국내 육성 16품종의 판별이 가능하였다. 따라서 17종의 SCAR 마커를 적용하여 총 31품종의 국내 육성 또는 도입품종의 구분이 가능하였으며 이들 SCAR 마커는 금후 사과 국내 육성 품종 판별을 위해 효과적으로 이용될 수 있을 것으로 판단되었다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제42권1호
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• pp.25-33
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• 2015

배 검은별무늬병 고도저항성 '93-3-98'과 고도감수성 '스위트스킨'간의 suppression subtractive hybridization 분석을 통해 '93-3-98'에서 특이적으로 발현되는 pathogenesis-related 10 (PR-10) 유전자를 분리하여 PyrcpPR-10으로 명명하고 기관 및 품종별 발현양상을 분석하였다. 단편염기서열의 rapid amplification of cDNA ends PCR을 통해 PyrcpPR-10 유전자는 전체길이가 743bp이고, 480bp의 ORF와 159개의 아미노산을 가지는 것으로 확인되었다. PyrcpPR-10 유전자의 염기서열은 '황실리'(저항성), '감천배'(중도저항성), '원황'(중도감수성), '신고', '스위트스킨'(고도감수성)은 동일하였으나 'Bartlett'(고도저항성)은 일부 염기서열의 차이를 보였다. BLAST X를 통한 다른 식물 종의 PR-10 아미노산과 비교에서 64 ~ 98%의 상동성을 보였고 공통적으로 GXGGXG motif를 가지고 있었다. 기관 및 조직별 PyrcpPR-10 유전자의 발현량은 꽃잎이 가장 높았으며 다음으로 잎, 꽃대, 눈, 수피 순이었다. 저항성과 감수성 품종에 따른 PyrcpPR-10 유전자의 발현양상은 모든 품종에서 접종 24시간 후 급격히 증가였으며, 특히 'Bartlett', '93-3-98', '황실리'에서 높게 발현되었고 '감천배', '원황'의 경우 저항성 품종에 비해 상대적으로 낮았으며, 고도 감수성 '신고', '스위트스킨'은 발현이 가장 낮았다. 배에서 분리한 PyrcpPR-10 유전자는 검은별무늬병 저항성에 직접 연관되는 것으로 추정된다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제33권2호
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• pp.96-105
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• 2005

공시균인 S. longwoodensis IFO 14251의 autoregulators 및 receptor gene 탐색의 일환으로 기존의 Streptomyces속 receptor gene의 공통배열을 primer로 이용하여 PCR을 수행하였다. 예상되는 100 bp 크기의 단편을 pUC19 vector에 ligation하여 E. coli $DH5{\alpha}$에 transformation한 후, plasmid를 분리하여 BamHI을 처리하여 $2\%$ agarose gel에 전기영동한 결과, pUC19 외에 receptor gene PCR product가 100 bp 위치에 존재하는 것을 확인하였다. 형질전환된 plasmid로 PCR을 수행한 후, 염기배열을 결정하여 분석한 결과, Streptomyces sp. 유래의 receptor gene의 일부분임이 확인되었다. 따라서 S. longwoodensis IFO 14251에는 lysocellin 생산에 관여한다고 추정되는 autoregulator receptor protein을 코드하는 유전자가 존재할 것으로 예상되어 100 bp의 PCR product를 probe로 이용하여 Southern 및 colony hybridization을 통하여 4.4 kb의 SphI 단편을 가지는 plasmid(pSLT)를 제작하였고 이를 sequencing한 결과, Streptomyces 속 유래의 autoregulator receptor 단백질을 코드하는 유전자와 3개의 open reading frame(651 bp)을 확인하여 sltR이라 명명하였다. 유전자 해석 결과, 기존의 autoregulator receptor proteins과 비교시 $35{\sim}46\%$의 homology를 나타내었다. 재조합 단백질의 발현을 위해, sltR/pET-l7b plasmid를 제작하고 E. coli BL21(DE3)/pLysS을 host cell로 이용하여 재조합 단백질을 발현시켰다. SltR 재조합 단백질의 정제는 DEAE-Sephacel column chromatography와 DEAE-5PW chromatography(HPLC)를 통해 수행하였다. Gel filtration chromatography(HPLC, 55 kDa)와 SDS-PAGE(28 kDa)를 통해 분자량을 확인한 결과, 재조합 단백질은 dimer형태로 존재하는 것으로 확인되었다. 또한, 결합활성에 있어 A-factor type의 autoregulator에 대해 가장 강한 결합활성을 나타내었다.

• 한국환경농학회지
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• 제27권2호
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• pp.163-170
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• 2008

유기물이 많고 작물생육이 양호한 시설 및 논토양에서 우점하는 광합성 세균을 분리하여 대두박 등의 유기물질과 혼합하여 혼합유기질 비료를 개발하였고 상추에 대한 시용효과를 검토하였다. 광합성 세균은 시설 및 논토양에서 형태적으로 가장 분포도가 많은 균주를 선정하고 이를 SA16 균주로 명명하였다. 선발된 균주는 폭 $0.5{\sim}1.2{\mu}m$, 길이 $2{\sim}2.5{\mu}m$의 간균 혹은 구균에 가까운 형태로 관찰되었으며 16S rDNA 분석으로 1.3 kb DNA 단편을 얻어 염기서열을 분석한 결과 Rhodobacter sp.와 가장 유사한 것으로 나타났다. 질소기준으로 토양 검정시비 처리구와 동량인 혼합유기질비료 0.90 Mg $ha^{-1}$ 처리구는 대조구 보다 주당 엽수는 2장 정도 많았고 뿌리길이도 2 cm 정도 길었다. 혼합유기질 비료 시용량별 수확량은 $0.90{\geqq}0.45>1.35Mg\;ha^{-1}$ 순으로 많았으며 5% 수준에서 처리간에 유의성이 인정되었고 최대 수확량을 얻을 수 있는 적정 시용량을 2차 회귀곡선($y=-0.0008x^2+0.1174x+21.332,\;R^2=0.9951$)으로 구한 결과 0.72 Mg $ha^{-1}$로 나타났다. 수확 후 토양 공극율은 혼합유기질 비료1.35 Mg $ha^{-1}$ 처리구가 58.8%로 가장 좋은 것으로 나타났으며 혼합유기질 비료 처리에 따른 토양중 호기성세균의 분포는 혼합유기질 비료 0.90 및 1.35 Mg $ha^{-1}$ 처리구가 12.4, 및 $12.8{\times}10^6CFU\;g^{-1}$로 가장 높았다.

• 생명과학회지
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• 제30권1호
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• pp.88-95
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• 2020

유기용매 내성 세균인 Pseudomonas sp. BCNU 106을 10%(v/v) 톨루엔에 노출시킨 후 8시간 동안 random arbitrarily primed polymerase chain reaction (RAP-PCR)기법을 이용하여 메신져 RNA 발현 레벨을 조사하였다. 총 100개의 상향발현된 발현 산물 중에서 50개의 상보적인 단편들이 반복적으로 재현성있게 발현되는 것으로 확인되어, 이들을 클로닝을 하였으며 나아가 유전자 염기서열을 결정하였다. Blast analysis 결과, 톨루엔은 LysR family transcriptional regulator 그리고 RNA polymerase factor sigma-32같은 전사와 관련된 유전자들의 발현 레벨을 적응적으로 증가시키는 것으로 확인되었다. 그리고 톨루엔 스트레스 존재 하에서 inorganic ion 수송과 대사와 관련된 catalase와 Mn²⁺/Fe²⁺ transporter 유전자의 발현이 증가되었으며, 신호전달과 대사와 기능적으로 관련된 type IV pilus assembly PilZ와 multi-sensor signal transduction histidine kinase 유전자들의 발현 증가도 확인되었다. 한편 톨루엔 노출 후 탄수화물 수송과 대사와 관련된 beta-hexosaminidase 유전자발현 레벨이 증가하였다. 나아가 DNA polymerase III subunit epsilon, DNA-3-methyladenine glycosylase II와 DEAD/DEAH box helicase domain-containing 유전자들과 같은 DNA 복제, 재조합 그리고 수복에 관련성이 있는 유전자들의 발현 레벨 그리고 심지어는 ABC transporter 유전자와 같은 방어 메커니즘에 관련성이 있는 유전자들의 발현 레벨이 적응적으로 증가되는 것으로 밝혀졌다. 특히 10% 톨루엔 존재하에서 ABC transportor, Mn²⁺/Fe²⁺ transporter 및 β-hexosaminidase 유전자에 해당하는 RNA들이 괄목하게 유도되는 것이 확인되었다. 그러므로 유기용매 내성 세균 Pseudomonas sp. BCNU 106이 유기용매에 대하여 내성을 나타내는데 있어서 방어 메커니즘, 세포내 이온 항상성 그리고 바이오 필름 형성이 필수적인 것으로 확인되었다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제44권1호
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• pp.12-18
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• 2017

당귀는 우리나라를 포함하여 중국과 일본 등 아시아국가에서 유용하게 이용되는 한약재이다. 그러나 국가마다 그 기원을 달리하기 때문에 혼 오용이 심하고 국제시장에서 혼란을 불러일으킬 소지가 다분하다. 따라서 오래전부터 형태학적, 세포유전학적 분석과 지표성분을 이용한 화학적 판별 마커의 개발에 관한 연구가 많이 진행되어 왔다. 또한 최근에는 다양한 재배환경과 수확 후 가공 및 처리방법에도 비교적 안전한 유전자 단편의 염기서열 비교분석을 통한 분자생물학적 기술을 적용한 판별기술의 개발에 관한 연구결과 들이 발표되고 있다. 그러나 아직까지 이들 기술의 실용화를 통한 현장 적용에는 한계가 있으며 보다 많은 후속연구가 수행되어야 한다. 이에 본 논문에서는 현재까지의 연구결과를 바탕으로 얻어진 문제점을 논하고 향후 필요한 추가 연구 과제들에 관하여 기술하였다.

• 원예과학기술지
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• 제31권3호
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• pp.337-343
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• 2013

본 연구의 목적은 SSR과 SRAP 마커 시스템을 이용하여 팔레놉시스 14품종 간 유전적 거리를 비교하고, SSR 마커를 이용하여 품종 간 구분을 하기 위한 것이다. 전체적으로 111개의 SSR 프라이머와 30조합의 SRAP primer를 먼저 스크리닝하였다. 국립원예특작과학원에서 보존중인 국내 육성품종을 포함한 14품종의 팔레놉시스에서 12개의 SSR 프라이머와 30조합의 SRAP 프라이머에서 높은 다형성을 보였다. 증폭된 DNA 단편들은 acrylamide gel에서 분리시킨 후 silver staining 방법으로 검출하였다. SSR 마커 55개와 SRAP 419개로, 총 474개의 마커를 획득하였으며 이를 유전적 다양성 분석에 사용하였다. 다형성 밴드들은 MVSP 3.1프로그램을 이용하여 유전적 유사도와 UPGMA clustering 분석을 위해 scoring 되었다. 14 팔레놉시스 품종은 SRAP과 SSR 분석을 통해 각각 0.683과 0.66의 유사도 지수에서 3그룹으로 분류되었다. 또한 SSR 20번과 22번만으로도 이들 육성 품종을 구분할 수 있었다. 이 결과는, SSR 분석은 팔레놉시스 품종간 구분에 효과적이고 SRAP은 염기서열의 정보가 없을 때 유전적 다양성 분석에 유용하다는 것을 보여준다. 이번 연구된 SSR과 SRAP 마커들은 팔레놉시스의 유전자형 판별, 유전자원 보존, 유전적 근연관계를 분석하는데 유용한 기술이 될 것이다.

• Journal of Plant Biotechnology
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• 제31권1호
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• pp.1-6
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• 2004

한약재로 사용되는 방풍류는 절단되어 유통되므로 외부 형태적인 특징만으로 구분하기가 어려워 방풍류로 사용되는 방풍, 식방풍, 석방풍, 갯방풍 등 4종에 대해 PCR에 기초한 RAPD 마커를 이용하여 SCAR 마커를 개발하고자 하였다. RAPD 분석결과 밴드의 패턴은 다양하게 나타났으며 다형성의 밴드 수는 총 215개로 전체 밴드수의 98%였다. RAPD 분석에서 각 방풍류를 구별 할 수 있는 특이적인 밴드를 나타내는 primer는 방풍에서 4개의 primer, 식방풍은 6개의 primer, 석방풍은 4개의 primer, 갯방풍은 6개의 primer를 선발하였고, 그 중 특히 primer 425는 4종의 방풍류의 감별에 유용하였고, 이를 이용하여 SCAR마커로 전환하는데 이용하였다. 특이적인 단편을 클로닝하여 염기서열 분석으로 특이 primer를 제작하고 제작된 primer로 방풍류 시료 16개에 적용하였을 때, 국내의 야생에서 주로 자생하는 석방풍은 215 bp, 그리고 국내에서 가장 많이 재배 또는 생산되는 갯방풍은 177 bp와 300 bp에서 뚜렷하게 나타났다. 따라서 갯방풍과 석방풍의 감별 가능성을 제시할 수 있으며 개발된 SCAR 마커를 이용하여 시중에 유통되고 있는 방풍류 건조약재의 감별에 유용한 마커로 활용될 수 있을 것이다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제32권3호
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• pp.199-205
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• 2004

Bifidobacterium longum SJ32 균주로부터 cloning한 sucrose phosphorylase 유전자를 포함하는 8.6 kb의 EclRI 단편의 염기서열을 결정하였다. 5개의 open reading frame이 존재하였고, 상동성 검색의 결과, sucrose대사에 관여하는 sucrose phosphorylase (ScrP), sucrose transporter (ScrT), GalR-LacI-type transcriptional regulator (ScrR) 유전자의 존재를 확인하였다. SJ32 균주의 scrPTR 유전자군은 다른 B. longum균주의 scrPTR과 배열이 동일하고, 각 유전자 산물이 아미노산 수준에서 94%이상의 상동성을 가지고 있지만, 주변 유전자는 다르게 나타나 B. longum균주 간의 scrPTR 유전자군의 horizontal transfer를 추정하게 한다. 대장균에서의 scrP와 scrT의 동시 발현은 세포 내로의 sucrose 유입을 증가시켜 sucrose phosphorylase의 활성 증가에 영향을 주는 것으로 나타나, scrT가 sucrose transporter유전자임을 뒷받침한다. 기존에 보고된 B. longum NCC2705균주의 유전체로부터 scrPTR외에도 sucrose대사에 관여하는 다양한 sucrose multiple transport system에 관여하는 유전자의 존재가 확인되어, B. longum이 다양한 sucrose유입체계를 보유하고 있음이 추정된다.