본 연구에서는 세포의 성장속도, 배양표면 부착, 체내 특이성을 유지에 중요한 요소인 세포외 기질 물질에 따른 심근세포주(HL-1 cell)의 성장, 생존률 및 표현형 등을 분석했다. 서로 다른 5 가지의 세포외 기질 환경을 조성하여 세포 성장에 미치는 영향에 대하여 분석했다. 세포외 기질 물질이 처리된 배양 표면의 물리적인 형태는 원자현미경을 통하여 분석했으며, 세포의 표면부착, 성장 및 증식과 생존률 및 표현형은 역상형광현미경 및 면역염색법을 통해 분석했다. 본 연구를 통하여 서로 다른 세포외 기질 물질이 세포의 부착 및 성장 속도에 영향을 미치며, 심근세포의 특이성을 나타내는 단백질의 형성에도 차이를 보이는 것을 확인했다.
기질농도, HRT, 온도, pH, $Ca^{2+}$ 농도변화에 따른 반응기의 생물막형성과 세포외고분자물질의 조성변화에 따른 기질 제거율을 살펴보았다. 그 결과 반응기의 초기 생물막 형성은 각 조건에 따라서 약간의 차이를 보였다. 반응기 운전 초기에 균에 의해 생산된 세포외고분자물질은 점액질의 형태로 세포벽에 부착되어 주위환경의 해로운 요인으로부터 세포를 보호하는 기능을 가지고 있어 생물막 형성을 촉진시키는 역할을 하였으나, 생물막이 안정화된 후에는 오히려 생물막의 산소투과와 영양분의 접촉을 떨어뜨리는 역할을 하여 기질 제거율을 저하시키는 작용을 하는 것으로 나타났다.
교원질을 비롯한 세포외기질의 생합성을 통해 피부장력과 탄력 등 피부 특성을 제공하는 진피섬유모세포는 피부노화와 함께 활성이 감소되어 주름 형성의 이유가 된다. 따라서 젊고 건강한 피부를 유지하기 위해서는 진피섬유 모세포의 활성화가 큰 의미를 지닌다. 본 연구에서는 대복피 에탄올추출물이 진피섬유모세포의 세포외기질 합성에 미치는 영향을 ELISA, Western blot analysis 및 RT-PCR 등의 in vitro 평가법으로 측정하였다. ELISA와 western blot analysis에서 대복피추출물은 제1형 교원질, fibronectin, transforming growth factor-${\beta}1$ (TGF-${\beta}1$)의 생성을 촉진시켰고, RT-PCR에서는 COL1A1, TGF-${\beta}1$, keratinocyte growth factor (KGF), insulin growth factor (IGF)-1의 유전자 발현을 증가시켰다. 이상의 결과로부터 대복피추출물은 진피섬유모세포에서 세포외기질의 생성을 촉진시키는 천연소재인 것으로 판단되었다.
계배 limb bud 간충직 연골원성 세포로부터 연골세포로의 분화에 미치는 transforming growth factor-f2(TGF-$\beta$2)의 영향을 알아보기 위하여, Hamburger-Hamilton stages 23/24의 간충직 세포들을 미세배양법으로 배양하면서. TGF-$\beta$2의 농도 및 처리시간에 따른 연골세포의 분화에 미치는 영향을 조사하였다 그 결과 TGF-$\beta$2는 배양 첫 24시간 동안 1-2 ng/ml의 농도로 처리하였을 때 가장 효과적으로 연골세포의 분화를 촉진하였으며, 또한 TGF-$\beta$2의 처리군에서 배양 3일째에 tsss) sulfate의 glycosaminoglvcan으로의 유입량이 현저히 증가함을 보였다 한편. 배양 48시간내에TGF-$\beta$2를 처리한 경우 분화를 촉진 유도한 반면, 배양 48시간 이후에 처리하였을 때에는 분화 촉진 효과가 나타나지 않았다. 이상의 결과로부터 TGF-$\beta$2는 연골원 세포의 분화 초기단계에 세포외기질의 합성을 촉진시켜 세포응축을 유발하고. 세포-세포 및 세포-세포외기질의 상호작용을 증대시킴으로써 연골세포로의 분화를 촉진시킬 것으로 추정되었다.
착상기 이전 자궁에서 특이적 자궁내막 준비가 진행되어야 하는데, 이는 자궁 내막의 점진적 분화로 배아의 착상과 성공적 임신에 절대적으로 필요하다. 배아 발생 동안에 관찰되는 조직의 재구성은 세포외 기질을 포함한 다양한 요인에 의해 조절된다. 임신 동안에 관찰되는 극적인 변화로는 배아의 이동, 탈락막 반응, 태반의 분화를 그 예로 들 수 있다. 배아와 자궁간의 성공적 착상을 위한 변화들은 배아와 자궁의 착상을 위한 능력 갖출 수 있도록 한다. 이러한 변화과정 중에, 콜라겐이 주성분인 세포외 기질의 극적인 변화가 진행된다. 이러한 변화는 매우 복잡하여 그 기작을 밝히는 것은 쉽지 않으나, 최근 들어 PCR-select cDNA subtraction 방법, microarry 방법 등 대단위 유전자 동정 방법들을 이용하여 많은 후보 유전자가 동정되었다. 스테로이드 호르몬은 임신과 임신 유지에 중요한 역할을 수행하며, 세포외 기질의 재구성을 엄격하게 성스테로이드 호르몬에 의한 유전자 네트워크를 통하여 조절한다. 자궁의 세포외 기질의 병리적 조절이 당뇨병 등에서 보고되고 있다. 세포외 기질의 재구성은 착상과 태아와 자궁의 발달을 이해하는 데 중요하고, 또한 생식과 관련된 질병을 극복하는 데 중요하다. 비록 세포외 기질의 구성성분이 매우 다양하고 복잡하여 논의할 것이 무척 많으나, 본 종설에서는 착상기를 전후한 시기에 콜라겐의 변화를 중심으로 논하였다.
골수내 정상적인 혈구형성은 줄기세포와 주위의 미세환경 사이에 일어나는 상호작용에 의해서 좌우된다고 알려져 있다. 이때 미세환경은 성장요소, 기질세포 및 기질세포가 분비한 세포외기질의 복잡한 망상구조로 이루어져 있다. 골수의 세포외기질은 거대분자로 구성되어 있으며 이중 구성요소의 일부인 당단백이 혈구형성의 조절에 주요한 요소가 된다고 많은 학자들이 주장해 왔다. 골수의 기질을 이루고 있는 망상세포, 지방세포, 섬유모세포, 혈관내피세포 및 혈관주위세포 등이 분비하는 세포외기질에 여러종류의 laminin 동형체가 함유되어 있으며 여러 종류의 혈구형성에 주요한 역할을 한다는 연구보고가 있다. 저자는 골수내 종양을 치료하기 위해 빈번히 사용되는 cyclophosphamide가 골수에 미치는 영향을 규명하고자 실험동물의 혈구형성에 영향을 미치는 laminin-1의 발현의 변화를 골수의 기질세포에서 추적하고자 하였다. 건강한 SD계 흰쥐를 실험동물로 사용하여 cyclophosphamide를 체중 kg당 75 mg을 복강내로 1회 투여하고 3일, 1주, 3주 및 5주 후 희생하여 골수조직을 채취하여 면역조직염색법으로 염색하여 laminin-1의 골수내 분포의 변화를 관찰하였고, 일부 조직은 전자현미경표본을 제작하여 1차 항체(rabbit anti-laminin)로 반응시킨 후 직경 12 nm의 금과립이 섞인 제2차 항체(biotinylated goat anti-rabbit IgG)로 다시 반응시키고 uranyl acetate로 단일염색 후 전자현미경으로 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. Cyclophosphamide 투여 후 3일 경과군의 흰쥐 골수조직은 정맥동이 확장 되었고, 일부 조직이 괴사되었으며, 혈구형성세포가 감소되었다. 망상조직과 지방세포사이의 조직에서 laminin-1의 면역반응이 강하게 나타났다. 2. Cyclophosphamide 투여 후 1주, 2주 및 5주 투여군의 골수에서 laminin-1의 약한 면역반응이 기질조직에 계속되었고 혈구형성세포의 수는 증가되었다. 3. Laminin-1의 면역반응을 나타내는 금과립은 cyclophosphamide 투여 3일군의 골수 기질세포에서 가장 많은 수가 관찰되었고, 투여 1주, 3주 및 5주군에서는 금과립의 수량이 감소되었다. 이상과 같은 실험결과는 cyclophosphamide가 흰쥐에 투여되었을 때 골수의 혈구형성의 미세환경을 유지하는 기질세포의 laminin-1의 발현을 증가시키는 것으로 생각되었다.
동충하초 Paecilomyces tenuipes C240의 균사체 배양과정에서 균사체 성장, 세포외 다당체 생산, 기질감소 속도를 표현할 수 있는 동력학적 모델을 제시하였다. 균사체 성장은 Logistic식을, 세포외 다당체 생산은 Luedeking-Piret 식을, 기질소모는 Luedeking-Piret 유사식을 각각 적용함으로써, 전체 균사체 배양과정을 예측할 수 있었다. 모델식에서 사용된 주요 kineti, constant들은 다음과 같다: 균사체의 최대 비성장속도${\mu}m,\;0.7281\;h^{-1};$; 다당체 생산에서의 growth-associated constant $(\alpha),\;0.1743g(g\;cells)^{-1}$; non-growth-associated constant $(\beta),\;0.0019g(g\;cells)^{-1}\;;$ maintenance coefficient ($(m_s),\;0.0572g\;(g\;cells)^{-1}$·5L 발효조에서 얻은 균사체 성장, 세포외 다당체 생산, 기질감소 속도자료들을 모델에서 예측한 결과와 비교한 결과 서로 잘 일치하는 것으로 보아, 본 연구에서 제안된 모델식은 이 동충하초 균사체 배양공정의 scale-up등의 프로세스 설계에 응용가능 할 것이며, 다른 종류의 동충하초 균사체 배양공정에도 적용가능 할 것으로 판단된다.
본 연구에서는 A. blazei의 DO-스탯 현탁 유가식 배양을 통하여 균사체 및 세포외 다당체 생산을 극대화하고자 하였다. 탄소원만을 포함하는 기질 공급액을 사용하는 경우보다 질소원이 적절히 첨가된 혼합 기질 공급액을 사용하는 것이 균사체 및 세포외 다당체 생산에 보다 효과적이었다. 기질공급액 중의 탄소원 조성을 달리하여 실험을 수행한 결과, 덱스트린을 배제하고 포도당만을 탄소원으로 사용하였을 때 가장 높은 균사체 및 세포외 다당체 생산성을 얻을 수 있었다. 이 때의 균사체 농도 및 생산성은 각각 36.5 g/l, 0.37g/l-h이었으며, 세포외 다당체 농도 및 생산성은 각각 10.9 g/l, 0.11 g/l-h이었다. 이는 회분식 배양 결과와 비교하여 균사체 농도 및 생산성 면에서는 각각 6배 및 2.2배, 세포외 다당체 농도 및 생산성 면에서는 각각 4.7배 및 1.8배 증가한 값이다. 이상의 결과들로부터 A. blazei의 고농도 균사체 배양을 위해 유가식 배양 방법이 매우 효과적임을 알 수 있었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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