비만은 에너지의 섭취와 소비의 불균형으로 지방조직이 비정상적으로 분화하면서 생기는 대사질환으로 알려져있다. 본 연구에서는 본 연구는 적양파 추출물 처리에 따른 Pancreatic lipase 억제, 지방세포분화 억제 활성을 확인하고자 하였다. 적양파추출물 처리에 따른 활성은 지방세포 분화 및 관련 유전자에 대한 평가는 3T3-L1 지방전구세포를 이용하고 Real-Time PCR을 통하여 확인하였다. 실험 결과, Pancreatic lipase 활성 억제 실험에서 적양파 추출물은 농도 의존적으로 lipase 활성을 억제하였다. 지방세포분화 실험을 수행한 결과, insulin, dexamethasone, 3-isobutyl-1-methylxanthine(MDI)등으로 분화 유도된 3T3-L1 세포에서 적양파 추출물은 지방전구세포의 분화를 억제하였으며 동시에 지방구 형성을 억제하는 것으로 나타났다. 또한, 지방전구세포의 분화 과정과 관련된 C/EBP-α, C/EBP-β, PPAR-γ의 발현을 억제하였다. 본 실험에서 적양파 추출물은 지방분해효소를 억제하며, 지방전구세포 분화와 관련된 유전자 발현을 억제함으로써 지방세포 분화 및 지방구형성을 억제할 수 있는 항비만 소재로의 개발 가능성이 높다고 판단된다.
본 연구는 지방감소를 위한 소재개발로 감국 유산균 발효물이 갖는 지방구세포 분화 억제효과를 관찰하였다. 감국 추출물의 세포독성을 극복하는 유산균의 발효물을 제작하였다. 3T3-L1 세포주에서 감국 추출물 및 발효물이 갖는 세포독성은 모두 없었다(1day culture). 감국 추출물 처리 대조군과 비교하여 3T3-L1 세포주에 처리시 증식 유도된 발효물을 선별하였다. 감국 추출물 및 발효물의 분화억제 및 세포생존률 FACS분석은 분화 유도된 세포가 모든 실험군에서 줄어들었다. 3T3-L1 세포주에서 감국 추출물과 발효물 처리가 protein kinase B (Akt) pathway활성이 증가하였고, 단백질 발현은 지방구세포로 분화되면서 Gli2의 수준은 감소하였다. Hedgehog를 조절하는 유산균은 KCTC 3115인 것을 알 수 있었다. 분화와 관련된 KCTC 3115 및 KCTC 3109 발효군에서 단백질 수준에서 C/EBPα 및 FAS를 감소, pACC는 증가시키는 것을 확인하였다. 감국 추출물과 4개의 감국 유산균 발효물 중 Lactococcus lactis subsp. lactis KCTC 3115 발효물이 지방구세포 분화 신호를 더 효과적으로 조절하고, hedgehog을 같이 조절하여 지방전구세포의 분화를 억제하는 것을 알 수 있었다. Hedgehog 신호를 조절하면서 분화를 억제하는 물질에 대한 연구가 더 필요할 것으로 판단된다. 따라서 감국 발효물의 생리활성 물질 중 향후 매커니즘 분석을 위한 활성물질의 자료가 더 필요할 것으로 여겨지며, 감국 추출물 및 감국 발효물의 hedgehog 신호조절이 새로운 비만치료제로 개발될 수 있음을 위한 가능성을 제시하고자 한다.
본 연구에서는 영지버섯 균사체 발효 꾸지뽕 잔가지 추출물의 지방세포 분화 억제 및 염증 억제 효과를 확인하고자 하였다. 세포독성을 확인한 결과, 최대 1,000 ㎍/mL 농도까지 세포에 처리하여도 세포 생존율이 감소하지 않음을 확인되었다. 분화과정 동안 발효 꾸지뽕 잔가지 추출물을 처리하였을 때, 세포 내 지방 축적이 감소되었다. 분화과정에 관여하는 대표적인 adipokine인 leptin과 adiponectin의 생성량을 확인한 결과, 발효 꾸지뽕나무 잔가지 추출물에 의해 adiponectin의 생성 증가와 leptin의 생성 감소를 확인하였다. 지방세포 분화 관련 유전자의 발현은 분화 유도인자만 처리한 군에 비해 발효 꾸지뽕나무 잔가지 추출물이 함께 처리된 군에서 추출물의 농도가 높아질수록 지방분화 전사인자인 PPARγ와 C/EBPα의 발현량이 감소하는 것을 확인하였다. 분화된 3T3-L1 세포에서 LPS에 의해 분비되는 염증성 사이토카인(TNF-α, IL-6, MCP-1)의 생성량 변화를 측정한 결과, LPS 처리로 증가된 염증성 사이토카인의 생성을 억제하였으며 염증 관련 유전자인 iNOS, COX-2의 발현도 감소되었다. 또한, 발효 꾸지뽕나무 잔가지 추출물과 발효되지 않은 꾸지뽕나무 잔가지 추출물을 비교하였을 때, 발효 꾸지뽕나무 잔가지 추출물이 지방세포 분화 및 염증 억제 효과에서 더 높은 활성을 보였으며, 이들 결과를 종합적으로 볼 때, 영지버섯 균사체를 이용한 발효가 꾸지뽕나무 잔가지의 활성 증가에 기여하는 것으로 보인다. 따라서 발효 꾸지뽕나무 잔가지 추출물은 항비만, 항염증 소재로서 비만뿐만 아니라 대사성 질환 개선을 위한 기능성 소재로서 활용이 가능할 것으로 판단되며, 향후 발효 꾸지뽕나무 추출물의 명확한 항비만, 항염증 효능을 확인하기 위해서는 유용 물질 분리 및 작용기전 등 추가적인 연구가 필요할 것으로 판단된다.
여러 천연물 추출물 140종의 파골세포 분화처제효과 검색은 파골세포의 마커 enzyme인 TRAP활성으로 확인하였다. 그 결과 파고지$^{3}$, 지각$^{13}$, 금령자$^{6}$, 시호$^{9}$, 황연$^{69}$, 배양인삼$^{98}$, 구맥$^{26}$, 등 대부분의 추출물이 $100{\mu}g/mL$ 농도 이상에서는 높은 세포 독성을 보여서 파골분화 억제 정도를 확인 할 수 없었고 세포독성이 없는 농도를 선정하여 파골세포 분화억제 정도를 재검색한 결과는 천연물 중 파고지$^{3}$, 호두$^{21}$, 용안육씨$^{77}$, 황금$^{78}$, 정공등$^{37}$ 메탄올 추출물과 생대추과육$^{128}$, 콩나물$^{70}$ 열수 추출물은 비교적 낮은 농도에서도 30% 이하의 TRAP 활성을 보여 파골분화 억제 효과가 우수하게 나타났다. 이 중 전통 한약재인 황금$^{78}$ 메탄올 추출물과 과일류인 생대추과육$^{128}$ 열수 추출물이 $10{\mu}g/mL$의 낮은 농도에서도 가장 좋은 파골분화 억제 효과가 나타났다.
본 연구는 MC3T3-E1 조골 전구세포에 대두추출물을 처리 후 그 조건배양액에서 파골세포분화 관련 국소인자 중파골세포분화 촉진인자(IL-$\beta$, IL-6, RANKL, TNF-$\alpha$, M-CSF) 및 파골세포로의 분화억제에 관여하는 국소인자인 OPG의 발현변화를 조골세포 조건배양액에서 살펴보았으며, 이 조골세포 조건배양액을 RAW264.7 파골전구세포에 처리 시 파골세포로의 분화를 억제정도를 TRAP 염색 및 관련 분화 지표의 발현을 통해 알아보았다. 대두추출물 처리한 조골세포 조건배양액에서 OPG의 발현이 농도 의존적으로 현저히 증가하였다. 그러나 강력한 파골세포 분화촉진인자로 알려진 IL-1$\beta$의 발현 역시 고농도의 대두추출물 처리 시 현저히 증가하여 고농도의 대두추출물을 처리한 CM 처리 시 TRAP 염색된 일부 파골세포를 확인하였고, 파골세포분화 관련지표인 MMP-9의 발현 또한 저농도 대두 추출물을 처리한 CM 처리에 비해 증가하였다. 이는 저농도의 대두추출물이 고농도의 대두추출물에 비해 파골세포분화억제에 효과적임을 의미하나, 추후 파골세포수준에서 분화억제 관련 기전연구가 필요할 것으로 생각되어진다.
파골세포의 분화에 대한 시금치 추출물의 영향을 확인하고자 RANKL을 처리한 RAW264.7 세포에서 세포독성, TRAP(+) 다핵세포의 형성, 파골세포 분화 관련 유전자의 발현, 그리고 단백질 발현을 확인하였다. 물과 25, 50, 75 및 100% 에탄올 시금치 추출물의 세포독성을 측정한 결과 모든 추출물들이 $100{\mu}g/mL$ 이하의 농도에서 RAW264.7 세포에 독성을 유발하지 않았다. TRAP 염색을 통해 TRAP(+) 다핵세포의 수와 효소 활성을 측정한 결과 물 추출물을 제외한 모든 추출물이 대조군에 비해 분화 억제 및 효소 활성 저해 효과가 있었다. 특히 $100{\mu}g/mL$ 농도의 100% 에탄올 추출물은 RANKL만 처리한 대조군과 비교해 80%의 유의한 TRAP(+) 다핵세포 숫자 감소와 44%의 TRAP 효소 활성 저해율을 보였다. 시금치 에탄올 추출물은 RANKL에 의한 파골세포 분화의 지표가 되는 관련유전자인 NFAT, c-FOS, cathepsin K 및 TRAP의 발현을 억제하였다. 또한 단백질 수준에서 시금치 에탄올 추출물은 RANKL에 의해 증가된 NFATc1의 발현을 현저히 감소시키는 것으로 확인되었고, 또한 c-FOS의 활성화 형태인 인산화된 c-FOS의 발현뿐만 아니라 인산화되지 않은 비활성의 c-FOS 발현도 감소시켰다. 반면 파골세포의 분화에 직간접적인 영향을 미친다고 알려진 MAPK 중 ERK의 활성에는 거의 영향을 미치지 않는 것으로 보아 시금치 에탄올 추출물은 c-FOS의 활성, 비활성형 전체를 감소시킴으로 파골세포 분화를 감소시키는 것으로 확인되었다.
세포분화에 따른 Small GTP-binding protein의 역할을 밝히기 위하여 Retinoic acid(RA)와 dibutyryl cyclic AMP(dbcAMP)로 분화를 유도한 F9 기형암종세포의 형태적인 변화와 함께 Small GTP-binding protein의 분포를 조사하였다. RA와 dbcAMP를 처리한 세포는 분화유도 5일경(초기 분화 단계)에 분명한 세포의 경계를 보이기 시작하여 7일경(분화 후기 단계)에는 거의 모든 세포가 등근 분화된 형태로 전환되었다. 이 분화과정 동안 세포막에는 많은 microvilli와 lamellopodia 같은 구조물이 나타났다. 아울러 초기 분화 단계에 많은 량의 laminin이 발현되었으며 분화 후기에 microtubule의 재분포가 관찰되었다. 세종류의 Small GTP-binding protein(25 23, 21 KD)이 F9 세포의 막성분과 세포질에서 관찰되었으며 분화가 진행됨에 따라서 세단백질 모두 증가되는 양상을 보였다 이러한 결과는 Small GTP-binding protein이 F9 세포의 분화에 특별한 기능을 가지고 있음을 시사해 주고 있다.
비쑥(Atermisia scoparia)은 국화과에 속하는 한해살이 풀로서 유라시아 지역 분포하며, 염생습지에 자생하는 염생식물의 일종이다. 비쑥은 민간요법에서 이뇨제, 소염제, 간염치료제로 사용되어 왔으며, 비쑥에서 분리한 플라보노이드, 쿠마린 화합물의 항산화, 항염증 등의 생리활성이 보고되어 있다. 본 연구에서는 비쑥 추출물이 3T3-L1 지방전구세포 모델에서 지방세포 내에서의 중성지방 생성 및 지방세포 분화조절 인자 발현에 미치는 영향을 검토하였다. 지방전구세포 3T3-L1을 지방세포로 분화하여 Oil Red O 염색법으로 지방세포 분화 정도를 측정한 결과, 비쑥 추출물 처리군에서 농도 의존적으로 지방세포 형성이 억제되었다. 또한 지방세포 분화 관련 인자인 $PPAR{\gamma}$, $C/EBP{\alpha}$, SREBP-1c의 발현을 mRNA 및 단백질 수준에서 확인한 결과, 비쑥 추출물을 처리한 군에서 지방세포분화 인자 발현이 감소하는 것으로 나타났다. 지방세포 분화 및 증식에 관여하는 것으로 알려져 있는 MAPK 신호전달 경로를 확인한 결과 비쑥 추출물을 처리한 군에서 p38, ERK, JNK의 인산화가 억제되었다. 이를 통해 비쑥 추출물은 MAPK 신호전달 경로를 통한 지방세포 분화 인자 조절을 통해 지방 생성과 합성을 억제하는 것으로 사료된다. 따라서 본 연구 결과로부터 비쑥 추출물의 MAPK 신호전달 경로 억제를 통한 항비만 효과를 확인하였으며, 나아가 건강 기능성 식품 소재로서의 개발 가능성이 기대된다.
본 연구에서는 초과 에탄올 추출물을 이용하여 3T3-L1 지방전구세포에서 지방세포로의 분화 연구를 통해 항비만 활성을 확인하고자 하였다. 초과 에탄올 추출물에 의한 지방세포 분화 억제 활성 및 지방형성에 미치는 영향을 확인하기 위해 3T3-L1 지방전구세포에 분화를 유도하면서 추출물을 농도별로 처리하였고, 그 결과 초과 에탄올 추출물은 3T3-L1 지방전구세포에서 지방세포로의 분화를 농도에 의존적으로 감소시켰다. 이 같은 활성에 대한 작용기전을 알아보기 위해 지방세포 분화에 중요한 역할을 담당하고 있는 peroxisome proliferator-activated receptor ${\gamma}$ ($PPAR{\gamma}$)와 CCAAT-enhancer-binding protein ${\alpha}$ ($C/EBP{\alpha}$), 그리고 지방세포 분화에 관여하는 유전자들의 활성을 확인해 보았다. 실험 결과 초과 에탄올 추출물은 $PPAR{\gamma}$와 $C/EBP{\alpha}$의 유전자 및 단백질 발현을 유의적으로 감소시켰고 지방세포 분화에 관여하는 adipogenesis marker 유전자들의 발현을 억제 시켰다. 따라서 초과 에탄올 추출물은 지방분화 및 adipogenesis 억제 활성을 통해 항비만 소재로의 가능성이 있을 것으로 기대한다.
현대사회에서 스트레스, 환경오염 등으로 인하여 중년남성의 전유물로 여겨져 왔던 탈모가 젊은 사람들에게서도 나타나며, 탈모로 고민하는 인구가 약 700만 명 이상으로 추산되고 계속해서 증가하는 추세이다. 우리나라 탈모관련 시장은 현재 약 4조원 규모이며 지속적인 성장세에 있으며, 주로 한약재등 천연추출물을 혼합하여 제품화하였다. 본 연구에서는 어성초, 금잔화 70% 에탄올 추출물을 이용하여 천연발모제 소재화를 목적으로 섬유아세포, 모유두세포, 지방전구세포에 대한 세포독성 및 지방전구세포 분화를 통한 발모 효능을 확인하여 약용작물을 이용한 향장품 소재화를 시도하고자 한다. 섬유아세포에 각 시료에 대한 세포 독성을 확인한 결과는 어성초 70% 에탄올 추출물을 50, 100, $500{\mu}g/mL$으로 처리하였을 때 107.3%, 109.6%, 128.2%로 세포 생존율이 증가하였다. 모유두세포에 대한 각 시료의 세포 독성은 나타나지 않았으며, 모발의 생육을 촉진하는 혈소판에서 유래하는 성장인자를 분비하여 모발 재생에 효과를 나타내는 지방전구 세포의 지방 분화 확인 결과 금잔화와 어성초 70% 에탄올 추출물을 $10{\mu}g/mL$의 농도로 처리하였을 때 각각 104.3%, 103.9%의 분화율을 나타내었고, 어성초 출물의 경우 처리 농도의 증가에 따라 지방분화율이 유의적으로 크게 증가하였다. 본 연구를 통해 육모용 모발제품 소재 개발을 위한 생약초 자원들의 in-vitro 육모활성관련 실험 결과 어성초와 금잔화는 각 세포에 대한 독성을 나타내지 않았으며, 어성초 70% 에탄올 추출물은 지방전구세포를 자극하여 지방 분화를 유도하는 것으로 확인되었다. 이상과 같은 결과로 어성초와 금잔화 70% 에탄올 추출물은 탈모관련 향장품 개발 소재로 높은 가능성을 가지고 있는 것으로 생각된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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