멜라닌 생합성은 tyrosinase의 효소적 산화반응에 의해 일어난다. 톳(Hizikia fusiformis)의 미백효과를 검증하기 위하여 메탄올, 헥산, 부탄올 및 물을 용매로 이용한 분획과정을 통해 톳 에탄올 추출물로부터 분획물을 제조하였다. 에탄올 추출물과 분획물들을 대상으로 B16F10 흑색종 세포에서 tyrosinase 활성 저해효과 및 멜라닌 생합성 억제효과를 평가하였다. 생쥐의 에탄올 추출물 및 수층 분획물은 미백효과를 나타냈지만, 세포독성은 나타내지 않았다. 에탄올 추출물은 시료들 중에서 가장 높은 미백활성을 보였다. 에탄올 추출물은 $100{\mu}g/ml$의 농도에서 arbutin $10{\mu}g/ml$의 활성보다 높은 저해활성을 보였으나, kojic acid $10{\mu}g/ml$의 활성보다는 낮은 저해활성을 보였다. 또한, 메탄올, 헥산, 부탄올 및 수층 분획물은 $100{\mu}g/ml$의 농도에서 arbutin $10{\mu}g/ml$의 활성과 유사한 저해활성을 보였다. 항산화 활성은 L-ascorbic acid를 양성 대조군으로 하여 수치를 비교하여 나타냈다. 에탄올 추출물 및 수층 분획물의 DPPH 라디칼 소거활성은 다른 시료들보다 비교적 높게 나타났다. 또한, 에탄올 추출물및 수층 분획물은 $500{\mu}g/ml$의 농도에서 LPS에 의해 유도된 iNOS 발현을 각각 82와 80% 감소시켰다. 이러한 결과들로 톳의 에탄올 추출물과 수층 분획물은 미백효과 및 피부 보호효과를 가지는 화장품 소재로 이용 가능할 것으로 기대된다.
미백은 멜라닌 세포 내 멜라닌 생성 억제 기능을 의미한다. 기존 미백소재의 피부 부작용 때문에 최근에는 천연 소재를 활용한 미백 연구가 활발히 진행되고 있다. 무화과(Ficus Carica L.)는 뽕나무과에 속하는 열매로 줄기와 잎 성분의 미백 활성은 보고되었으나 무화과 열매의 미백 활성은 알려지지 않아 본 연구를 통해 멜라닌 생성 억제, 항산화 및 항염증 활성을 규명하고자 하였다. 무화과 열매 추출물(Figs fruits extract, FFE)의 라디칼 소거 활성은 DPPH/ABTS 분석에서 최대 농도에서 대조군 대비 34.52±1.98%/60.71±1.26% 수준으로 관찰되었다. CCK-8 assay를 통한 FFE의 세포독성은 약 10% 농도부터 관찰 되어 독성이 없는 최대 농도를 5%로 설정하여 모든 실험에 적용하였다. FFE는 inducible nitric oxide synthase, cyclooxygenase-2, interleukin-6 및 tumor necrosis factor-α 유전자 발현 억제와 함께 NO 생성을 농도 의존적으로 감소시켜 항염증 활성이 있음을 알 수 있었다. 또한 미백 기능 규명을 위해 α-MSH로 자극된 B16F10 세포에서 FFE를 농도별로 처리한 결과 세포 내 멜라닌 생성을 유의하게 하향 조절했을 뿐만 아니라 시험관 내에서 tyrosinase 활성이 억제되었다. 또한 FFE는 RT-PCR에서 α-MSH 처리군에 비해 Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) mRNA 발현을 약 94.34% 감소시켰다. 마지막으로, FFE는 α-MSH로 자극된 B16F10 세포에서 MITF, cAMP response element-binding protein 및 tyrosinase 단백질 발현을 유의하게 감소시켰다. 이러한 결과를 통해 우리는 FFE가 tyrosinase 효소 활성을 직접적으로 억제할 수 있을 뿐만 아니라 α-MSH 신호 기전 내 MITF 유전자 발현 조절을 통해 멜라닌 생성을 억제할 수 있음을 확인하였다.
본 연구는 삼나무와 편백나무 정유의 tyrosinase 저해 활성과 DPPH (1,1-diphenyl-2- picryl-hydrazyl) radical 소거 활성, SOD (superoxide dismutase) 유사활성을 구명하여 정유의 미백 및 항산화 효능을 평가하였다. 본 연구를 통해 삼나무와 편백나무 정유의 미백 및 항산화 기능성 소재로 개발하기 위한 기초자료로 이용하고, 건조 중 발생하는 nVOCs의 부가적 가치를 확인하고자 하였다. 삼나무 및 편백나무 잎의 정유는 수증기 증류법으로 24시간 추출하였고, 목부는 고온 열처리기를 이용하여 80, 100, $120^{\circ}C$의 온도조건에서 열기 건조하여 건조 중 목부로부터 발생하는 부산물인 천연 휘발성 유기화합물(nVOCs, Natural Volatile Organic Compounds)을 응축액의 형태로 추출하였다. 삼나무 잎의 정유가 편백나무 잎의 정유 보다 미백 및 항산화 활성에서 모두 높은 효과를 나타내었고 건조 시 발생한 nVOCs는 온도가 올라갈수록 미백 활성이 높아지는 것을 확인할 수 있었으며 항산화 활성은 $120^{\circ}C$에서 발생한 삼나무 nVOCs에서만 나타났다.
본 연구는 배의 품종별 생육 단계에 따른 추출물의 총 페놀, 플라보노이드 함량 및 항산화 활성을 확인함과 동시에 세포 독성 및 멜라닌 생합성 억제능을 비교 평가하여 미백 소재로써의 사용 가능성을 평가하고자 국내 육성한 4가지 신품종과 신고 품종을 이용하여 비교 분석하였다. 총 폴리페놀 함량은 생육초기에 가장 높았으나 과일이 성숙할수록 낮아졌으며, 품종간에는 생육시기와 관계없이 추황배에서 높게 나타났다. 총 플라보노이드 함량은 총 폴리페놀보다 적은 함량으로 5품종 모두 생육시기별로 큰 차이를 보이지 않았다. 알부틴은 총 폴리페놀 함량과 같이 과일이 성숙할수록 낮아지는 경향을 보였으며 DPPH, ABTS 라디칼 소거활성을 분석한 항산화 활성도 감소의 폭은 달랐지만 비슷한 경향을 보였다. 높은 항산화 활성은 멜라닌 생합성 억제에도 효과적으로 작용하여 만개 후 90일까지는 감천배를 제외한 4품종에서 50% 내외의 높은 억제 활성을 보여, 이 시기까지의 배 과일 추출물은 우수한 미백활성을 가지는 것으로 확인되었다. 뿐만 아니라 세포독성이 극히 낮아 피부 안정성이 높은 기능성 천연 원료 및 미백 향장소재로써 이용 가능성이 충분한 것으로 판단된다.
본 연구에서는 차가버섯의 미백 활성 검증을 통하여 화장품 소재로써의 활용 가능성을 확인하였다. 차가버섯 추출물의 항산화 효과를 알아보기 위해 전자공여능을 측정한 결과 농도가 증가할수록 활성도도 증가하였으며 1,000 ㎍/ml 농도에서 82.1%의 우수한 전자공여능을 나타내었다. 또한 미백 효과를 검증하기 위해 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과 농도 의존적으로 저해활성이 증가함을 확인하였다. MTT assay를 통해 멜라노마 세포(B16F10)의 세포 생존율을 확인한 결과 100 ㎍/ml 이하 농도에서 80% 이상의 생존율을 나타내었다. 따라서 세포 관련 실험은 25, 50, 100 ㎍/ml 농도에서 진행하였다. B16F10 cell에 차가버섯 추출물을 처리하여 멜라닌 합성과 관련된 단백질 발현을 측정한 결과 농도 의존성에 따라 모든 인자에서 단백질 발현이 억제됨을 확인할 수 있으며 100 ㎍/ml의 농도에서 TRP-1, MITF는 40.1%, 64.2%의 발현량을 나타내었고 tyrosinase 및 TRP-2는 arbutin 보다 단백질 발현 저해가 우수한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 멜라닌 합성 관련 mRNA 발현 측정을 위해 B16F10 세포에 차가버섯 추출물을 처리한 결과, 농도가 증가할수록 mRNA 발현이 억제되는 것을 검증하였다. 이에 따라 차가버섯 추출물이 미백 활성을 가지는 화장품 소재로써의 가능성을 확인할 수 있었다.
본 연구에서는 단삼 열수 추출물의 human epidermal melanocye (HEM) 세포에서의 미백활성을 측정하였다. 버섯유래의 tyrosinase 저해능 측정결과 $1,000{\mu}g/mL$의 농도에서 42%의 저해율을 나타내었으며, HEM 세포내의 tyrosinase, 멜라닌 생합성 저해능은 $5{\mu}g/mL$에서 26, 25%의 저해능을 나타내었다. 단삼 추출물의 미백과 관련된 tyrosinase, tyrosinase related protein 1 (TRP-1), tyrosinase related protein 2 (TRP-2), microphthalmia associated transcription factor (MITF)의 단백질 및 유전자 양이 감소함을 나타내었다. 또한 그 상위 단계인 cAMP 발현이 $5{\mu}g/mL$ 농도에서 41% 감소하는 것을 확인하였다. 본 실험을 통하여 단삼 추출물이 cAMP를 효과적으로 억제함으로써, 이를 통해 tyrosinase 활성뿐만 아니라 TRP-1, TRP-2 그리고 MITF 발현을 효과적으로 저해 한다는 사실을 확인하여 기능성 미백 화장품 소재로서의 활용 가능성을 제시하고자 한다.
현재 치과에서 상용되는 치아미백법은 과산화수소와 레이저를 사용하여 의사가 직접 치료를 하고 있다 [1]. 단기간에 높은 미백효과를 얻기 위해, 고농도의 과산화수소를 이용하게 되는데, 이는 암 또는 심장병 등을 유발시키는 원인이 될수 있음으로 인체에 매우 유해하다 [3,4]. 우리는 식품의약품안정청에서 규제하고 있는, 카바마이드 퍼옥사이드(15%)를 사용하였다. 카마바이드 퍼옥사이드(15%), 수증기, 저온 대기압 플라즈마 제트를 사용하여 미백효과를 관찰하였다. 기체 유량은 1,000 sccm 이며, 공기와 질소를 사용하였다. 미백효과를 보기 위한 대상으로는 우치(牛齒)를 사용하였으며, 플라즈마를 처리하여 미백효과를 관찰하였다. 실험 대조시료군으로는 카바마이드 퍼옥사이드(15%)와 수증기(0.4%)를 첨가한 다음, 공기 플라즈마와 질소 플라즈마를 조사하여 비교해보았다. 수증기를 첨가한 이유는 활성산소의 농도를 높이기 위함이며, 탁월한 미백효과를 얻을 수 있다. 실험을 통하여 우치에 카바마이드 퍼옥사이드(15%)와 수증기(0.4%)를 처리한 경우 플라즈마의 미백효과가 탁월함을 보였다. 이때 CIE색좌표 ($L^*a^*b^*$)에서 명도도가 높아짐을 보았다. 미백효과에 대한 측정은 측색분광기(cm-3500d)를 이용하였다. 라만은 빛이 어떤 매질을 통과할 때 빛의 파장을 변화시켜 빛의 일부는 진행방향에서 이탈해 다른방향으로지행하는 현상을 산란이라고 한다. 이를 이용하여 빛의 파장을 변화시키는 현상을 라만산란이라고 한다. 이것을 이용하여 같은 우치의 표면을 플라즈마 처리 전 후를 라만을 통해 측정하였다. 대기압 저온 플라즈마에서 발생되는 ROS는 미백효과에 큰 영향을 미친다. 모든 실험의 플라즈마 처리시간은 최대 20분까지로 하였다.
상온에 준하는 저온의 플라즈마를 발생시키는 장치들이 개발되면서, 저온 플라즈마와 생체조직간의 상호작용에 대한 연구가 큰 관심을 끌고 있다. 플라즈마에서 발생되는 다량의 이온과 활성종, 그리고 UV 등이 박테리아나 세포들과 작용함으로 해서 암세포 사멸, 치아 미백, 박테리아 살균/멸균, 지혈등의 효과들이 나타나고 있으며, 이러한 효과들을 극대화할 수 있는 장치 개발과 플라즈마와 생체조직간의 상호작용 메카니즘을 규명하는 것이 중요한 이슈가 되고 있다. 나노 금입자를 암세포의 막단백질인 FAK의 항체와 결합시킨 중합체를 만들어서, 암세포 표면에 나노 금입자붙이고, 플라즈마를 조사했을 때, 나노 금입자가 부착되지 않았을 경우에 비해서, 5배이상 사멸률이 증가하였다.[1] 변색된 치아에 미백제의 주성분인 과산화수소를 도포하고, 10분간 플라즈마를 조사하게 되면, 과산화수소만 도포했을 때에 비해, 치아 표면의 색이 3배이상 밝아지는 것을 관찰할 수 있었다. 과산화수소를 플라즈마에 노출시켰을 때, 활성종인 OH의 생성이 2배이상 증가하였고, 플라즈마에 의한 OH 생성의 촉진이 치아 미백효과가 증대되는 주된 요인인 것으로 추측된다.[2] 플라즈마에서 발생되는 O, $O_3$와 같은 활성종들은 살균력이 뛰어나기 때문에, 저온 플라즈마를 의료기구의 소독/멸균에 응용할 가능성이 아주 크다. 대장균이나 구강 세균이 플라즈마 처리로 5분이내에 멸균되는 것을 확인하였고, 핸드피스와 같은 의료기구를 오염시켜서 멸균 테스트를 수행하고 있다.
알부틴, 유용성감초추출물(GLY), 아스코빌글루코사이드(AA2G), 에칠아스코빌에텔(EAE)은 현재 미백 기능성성분으로 가장 많이 사용되어지는 성분들이다. 위의 미백 성분 중 어느 성분을 같이 혼합하여 사용하였을 때 미백효과가 더 효과적인가를 알아보기 위하여 tyrosinase 활성 억제와 B-16 melanoma cells에서 MSH에 의한 멜라닌 생성 억제 정도를 측정하였다. 알부틴과 유용성감초추출물은 농도 의존적으로 정제된 tyrosinase 활성을 저해하였다. 유용성감초추출물(GLY)과 아스코빌글루코사이드(AA2G)를 같이 사용하였을 때나 유용성감초추출물(GLY)과 에칠아스코빌에텔(EAE)을 같이 사용하였을 때는 유용성감초추출물(GLY)을 단독으로 사용하였을 때보다 tyrosinase 활성 저해효과가 상승하였으나 알부틴과 다른 성분들을 같이 사용하였을 때는 그러한 현상을 보여주지 못했다. B-16 melanoma cell을 이용한 MSH로 유도된 melanin 생성실험에서는 유용성감초추출물 (GLY)과 에칠아스코빌에텔(EAE)을 같이 사용하였을 때 멜라닌 생성 억제 효과가 유용성감초추출물(GLY)을 단독으로 사용하였을 때보다 현저히 증가하였다. 유용성감초추출물(GLY), 알부틴, 아스코빌글루코사이드(AA2G), 에칠아스코빌에텔(EAE)의 복합물을 일반적인 크림제형에 혼합하여 $25^{\circ}C,\;45^{\circ}C$에서 30일간 안정성(stability)을 관찰하였으며 특이한 함량변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과로 미루어 볼 때 유용성감초추출물(GLY)과 아스코빌글루코사이드(AA2G), 에칠아스코빌에텔(EAE)은 같이 사용함으로서 미백효과를 더 상승시킬 수 있다고 사료된다.
본 연구는 도화를 70% 아세톤 추출하여 sephadex LH-20으로 분리한 후 8개의 분획물을 얻을 수 있었다. 미백효과 측정으로 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과 분획물 8의 경우 1,000 ppm에서 92.2%를 나타내었으며, 멜라노마 세포에 의한 tyrosinase 저해활성은 100 ppm에서 63.4%, 멜라닌 생합성은 저해능은 100 ppm에서 71.7%의 효과를 나타내어 분획물 8의 효능이 가장 우수하였다. 주름개선 효과 측정으로 elastase 저해활성을 측정한 결과 분획물 5, 7이 1,000 ppm에서 각각 71.4, 74.5%의 저해활성을 나타내었으며, collagenase 저해활성과 collagen 생합성량을 측정한 결과 분획물 8이 100 ppm에서 80.0% 이상의 저해활성을 나타내었다. 이상의 결과로 미루어 보아 도화 분획물의 미백 및 주름개선 효과가 있음을 확인할 수 있었고, 기능성 화장품 소재로서의 가능성을 확인할 수 있었다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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