• 미생물학회지
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• 제46권1호
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• pp.96-103
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• 2010

단백질의 N-글리코실화는 대표적인 번역 후 변형 중의 하나로 진핵생물 뿐 아니라 원핵생물에서도 발견된다. N-글리코실화는 단백질 상의 N-글리코실 서열인 N-x-S/T 위치에 지질과 연결된 올리고당(lipid-linked oligosaccharide, LLO)으로부터 올리고당 전이효소(oligosaccharyltransferase, OTase) 활성에 의해 글리칸(glycan)이 전달되어 당단백질의 합성이 이루어진다. 본 연구에서는 OTase의 세포내 활성을 측정하기 위하여 5/6-carboxyltetramethylrhodamine (TAMRA)이 도입된 형광펩타이드 TAMRA-DA$\underline{N}$Y$\underline{T}$K-$NH_2$를 이용하였다. OTase활성 측정은 단일 서브유닛으로 효소의 활성을 갖는 운동핵 편모충류인 Leishmania major Stt3p와 병원성 미생물인 Campylobacter jejuni PglB를 진핵생물과 원핵생물의 모델 효소로 각각 사용하여 Saccharomyces cerevisiae와 C. jejuni 유래 LLO와 형광 펩타이드를 반응시켜 당-펩타이드를 합성하였다. 합성된 당-펩타이드를 미반응한 형광펩타이드와 분리 및 당-펩타이드의 정량 분석을 위하여 Tricine SDS-PAGE, ConA 렉틴 컬럼 및 fluorospectrophotometer, HPLC를 사용하였으며, 당-펩타이드 분석을 통해 각 방법의 장단점을 비교하였다. 비교 분석 결과 Tricine SDS-PAGE를 이용한 형광 이미지 분석과, 렉틴 컬럼을 통해 분리된 당-펩타이드의 fluorospectrophotometer 정량법에 비해, HPLC를 이용한 방법이 OTase에 의해 생성된 당-펩타이드를 분석하는데 더 정확하고 정량적인 값을 제시하는 것으로 확인되었다.

• 공업화학
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• 제18권3호
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• pp.279-283
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• 2007

한 종류의 epoxide hydrolase (EH) 효소 자체가 광학수렴 가수분해(enantioconvergent hydrolysis) 활성을 가지는 Caulobacter crescentus의 epoxide hydrolase (CcEH) 유전자를 PCR로 클로닝하여 재조합시킨 Escherichia coli 생촉매를 개발하였다. 재조합 E. coli 세포 10 mg을 10 mM styrene oxide와 반응시킨 다음 기질과 반응생성물을 chiral GC와 HPLC로 각각 분석 한 결과, (S)-styrene oxide 기질에 대해서는 위치 선택적으로 에폭사이드 링의 ${\alpha}$-탄소를 공격하여 (R)-diol로 전환시켰다. 반면에 (R)-styrene oxide에 대하여는 ${\beta}$-탄소를 공격하여 (R)-diol로 전환시키는 위치선택성을 가지고 있었다. 재조합 CcEH를 단일 생촉매로 사용한 광학수렴 가수분해반응을 통해 20 mM racemic styrene oxide에 대하여 광학순도 85%의 (R)-phenyl-1,2-ethanediol을 수율 69%로 생합성 할 수 있었다

• 한국식품과학회지
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• 제41권2호
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• pp.173-178
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• 2009

연속식 효소적 에스테르 교환반응을 이용하여 무-트랜스 유지를 제조하기 위한 체계적이고 입체적인 최적조건을 확립하기 위하여 3가지 독립변수($X_1$: 원료유지 중 FHCO 함량(%), $X_2$: 반응온도($^{\circ}C$), $X_3$: 기질의 흐름속도(mL/min))를 선정하여 RSM을 통해 각각의 독립변수에 대한 종속변수인 TS 전환율(Y)을 표현한 회귀방정식은 Y = 93.1146$(X_3)^2$+ 3.2387($X_1$) ($X_3$) + 2.6038($X_2$) ($X_3$)으로 나타났다. 이 방정식을 이용하여 정준분석을 이행한 결과 35%(w/w)의 FHCO를 함유한 원료유지를 사용하고 PBEB 내에서 68.67$^{\circ}C$의 온도 하에서 원료유지와 효소가 충분히 접촉할 수 있도록 0.63 mL/min의 흐름속도로 연속식 공정을 수행하면 TS 전환율이 극대화 되는 것으로 나타났다. 한편, 트랜스 지방의 함량이 높은 유지를 대체하되 실제 산업체 현장에서 생산되는 기존의 유지를 대체하기 위해서는 TS 전환율 뿐만 아니라 효소적으로 생산된 에스테르 교환 유지의 SFC 경향을 기존 유지의 결과와 비교하는 작업이 필요한데, 이때 비교대상의 기존 유지로는 트랜스 지방 함량 및 이화학적 물성 측면에서의 예비실험 결과 대체 가능성이 가장 높은 크림용 마가린(margarine)을 선정하였으며, 이러한 기존의 유지를 대체할 수 있는 무-트랜스 유지를 제조하기 위하여 SFC 경향 및 TS 전환율을 동시에 고려한 연속식 효소적 에스테르 교환반응의 최적조건을 확립하였으며, 최적조건은 42.83%(w/w)의 FHCO와 57.17%(w/w)의 SO가 혼합된 원료유지를 기질로 사용하며 PBEB 내에서의 반응온도는 64.72$^{\circ}C$이고, 효소와 원료유지가 극대로 접촉하여 효소적 에스테르 교환이 이루어질 수 있도록 기질의 흐름속도를 0.40 mL/min으로 각각 유지하는 것으로 판명되었다. 이상의 최적조건 하에서 연속식 효소적 에스테르 교환반응에 의해 제조된 유지의 SFC 경향을 분석하되 기존의 크림용 마가린의 경우와 비교한 결과 유의적으로 유사함을 확인하였으며, 이로써 본 논문에 의해 생산된 유지는 크림용 마가린을 성공적으로 대체할 수 있는 것으로 판단하였다. 또한, 반응온도를 60$^{\circ}C$ 및 55$^{\circ}C$로 각각 설정하여 2 단계로 분리한 PBEB에서의 TS전환율 변화를 측정한 결과, 반응 30일 경과시점까지 66%이상의 TS전환율을 유지하였으며(효소활성 반감기=약 30일 이상), 단일단계의 반응온도 실험(효소활성 반감기=약 15일)과 비교 시 반감기를 두 배 이상 연장할 수 있음을 확인하였다.

• 생명과학회지
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• 제15권6호
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• pp.935-940
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• 2005

Coumarine이 부착된 인산결합 단백질 (PBP-MDCC)의 형광변화가 뉴클레오사이드 삼인산 가수분해과정에서 배출된 무기 인산의 양을 측정하기 위해 관찰되었다. PBP-MDCC 정제후, 형광 방출 스펙트럼은 형광세기가 PBP-MDCC의 몰비을로 약 $70\%$까지 직선형태로 증가하는 것을 보였다. 형광 신호와 인산 기준물질과의 상호관계 측정이 인산 농도-형광세기 표준곡선을 구하기 위하여 stopped-flow 기구에서 행하여졌다. dTTP 가수분해로 부터 나오는 에너지를 이용하여 이중나선 DNA를 풀어주는 단백질인 T7박테리오파지 나선효소를 dPTT라 반응 시켰을 때, 형광변화를 배출된 인산의 양으로 전환할 수 있었다. 인산 배출 결과는 단일가닥 Ml3 DNA가 T7나선 효소에 의한 dTTP가수분해반응을 여러배 증가시키는 것을 보인다. 뉴클레오타이드 삼인산 가수분해 반응에 있어서 종말점 분석 대신에, PBP-MDCC에 의한 연속적인 인산 배출 분석이 배출된 인산을 측정하는데 있어서 쉽고 편리한 방법임을 보였다.

• KSBB Journal
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• 제15권1호
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• pp.42-48
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• 2000

본 연구에서는 고정화 UK를 이용한 융합단백질의 절단방응에 대해 UK의 고정화, 고정화 UK의 특성과 절단방응, 절단반응 후의 분리정제 그리고 고정화 UK으 재생에 대해 실험하였다. 고정화 수율은 99% 이상이였고 고정화 후의 효소활성은 80%를 유지하였다. 융합단백질 전단반응에서 액상 UK와 고정화 UK를 이용한 회분식 반응 모두 약 70%의 절단반응을 얻었고, 특히 고정화 UK의 사용시 부반응이 매우 낮은 이점이 있었다. 컬럼식 절단반응에서는 기절의 주입속도에 따라 절단수율은 크게 변화하였다. 최적의 유속은 50%의 절단수율을 얻은 1 bed volume/h로 설정하였다. 고정화 효소반응의 이점인 안정성과 반복사용 측면에서는 액상 UK 대비 고정화 UK가 높은 열안정성을 보였고 낮은 pH에서는 10% 이상 높은 활성을 유지하였다. 반복사용을 위해 6M GuHCl을 사용하여 인위적으로 풀림, 재접힘을 한 경우 98%의 활성을 얻음으로 타당성이 있음을 제시하였다. 또한 목적 단백질의 분리를 위하여 산침전 후 expanded bed adsorption 크로마토그래피를 이용함으로써 연속화된 고수율의 정제공정을 가능하게 하였다. 이러한 고정화 UK를 이용한 절단방응 및 정제시스템을 구축함으로써 융합단백지의 생산공정에 매우 유용하게 사용될 것으로 생각되어진다.

• 생명과학회지
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• 제6권4호
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• pp.264-269
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• 1996

Allomyces macrogynus의 유주자에 대한 단일클론항에를 만들었다. 고정된 유주자를 주사하거나 유주자 단백질 용액을 주사함으로서 생쥐를 면역화 하였으며, 하이브리도마 세포들은 효소면역흡착법을 이용하여 검색하였다. 약 30개의 하이브리도마 클론이 유주자에 대한 항체를 생산하는 것으로 확인 되었으며, 이들중 일부는 단일세포클론으로 분리되었다. 이들이 만들어내는 항체는 정제되어, 간법면역형광법에 의하여 유주자의 표면에 반응하는 항체로 확인되었다. 또한, 하이브리도마 배양상등액을 이용하여 유주자의 성장에 영향을 미칠 수 있는 클론을 조사하여 보았다. 조사한 배양5상등액중 두가지의 하이브리도마에서 얻은 배양상등액이 germ tube 의 성정을 촉진하는 것으로 확인되었다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제2권1호
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• pp.53-62
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• 1998

리소솜 acid phosphatase(LAP)를 포함하는 리소솜 산성 가수 분해 효소는 세포 내,외 성분의 분해에 중요한 기능을 수행하며, 유미 양서류의 다리 재생 과정에서 LAP의 효소 활성도는 탈분화시기에 특이적으로 증가하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 멕시코산 도룡뇽의 일종인 axolotl(Ambystoma mexicanum)의 다리 재생 가정에서 정상적인 다리 재생 조직과 retinoic acid (RA)가 처리된 다리 재생 조직에서 LAP의 분포 및 발현을 면역 화학적 방법으로 조사하였다. Axolotl의 다리 재생 조직에서 한국산 도룡뇽(Hynobius leechii)의 LAP에 대한 단일 항체를 이용한 면역 반응도는 줄 탈분화시기에 있는 wound epidermis와 미분화된 중배엽성 세포인 blastema 세포, 탈분화 상태의 근육과 연골 부위 세포에서 나타나는 것으로 조사되었다. 또한 LAP의 면역 반응도는 재생단게의 초기에 점차 증가하여 탈분화시기 동안 최대치에 도달하였으며, 재분화가 시작되면서 basal level 까지 서서히 감소하는 것으로 나타나\ulcorner. 유미 양서류의 다리 재생 과정에서 골격 패턴의 복제를 유발시키는 것으로 알려져 있는 RA 처리는 LAP의 면역 반응도를 강화시키는 것으로 나타나\ulcorner. 즉, RA가 처리된 다리 재생 조직에서 LAP의 면역 반응도는 정상적인 다리 재생 조직에서 보다 강하게 나타났으며, 면역 반응도가 나타나는 시기 또한 연장되는 것으로 조사되었다. 이와 같은 결과는 다리 재생 조직에서 RA 처리가 탈분화시기의 연장에 관여한다는 것을 시사하고 있다.

• 한국미생물·생명공학회지
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• 제20권5호
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• pp.519-526
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• 1992

Bacillus pasteurii의 urease gene이 Escherichia coli HB101에서 발현된 Bacillus성 recombinant urease를 단일단백질으로 정제하고 그 효소학적 특성을, 별도로 정제한 B.pasteurii urease의 그것과 비교검토하였다. B.pasteurii urease gene이 cloning 된 E.coli HB101(pBU11)의 균체파쇄액으로 부터 TEAE-cellulose, DEAE-Sephadex A-50, Sephadex G-150, sephadex G-200 등의 이온교환 크로마토그래피와 gel filtration을 이용하여 E.coli내에서 발현된 B. pasteurii성제하였으며, 또한 B.pasteurii로부타 비활성도 185.2배의 urease를 정제하여 disc gel electrophoresis로 단일 단백으로 정제되었음을 확인하였다. 정제된 두 urease 들의 native 상태의 분자량은 공히 280,000$pm$10,000 정도로 확인되었고, SDS-electrophoresis에의 해 subunit 유무와 분자량을 확인한 결과도 67,000정도의 subunit 4개와 20,000의 subunit 1개로 된 $\alpha$$\beta$ 구조의 동일한 효소단백으로 추정할 수 있었다. Gene donor인 B. pasteurii와 cloning 된 균주 E. coli(pBU11)이 생산한 두 urease의 효소학적 특성을 비교 조사해본 결과 두 urease의 최적반응 pH는 공히 7.5로 나타났으며, pH에 대한 안정성도 두 ureaserk 공히 pH 5.5에서 10.5 사이에서 50% 이하로 활성이 떨어지지 않는 강한 pH 안정성을 보였다. 두 urese의 최적반응의 온도는 $60^{\circ}C$였으며, 비교적 온도에 대한 저항이 강한 효소임을 알았다. 두 urease의 활성에 미치는 금속이온의 영향은 $Ag^{2+}$, $Hg^{2+}$ 등에서 양효소가 모두 강한 저해현상을 받는 반면, $Mn^{2+}$, $Mg^{2+}$ 에서는 다소 촉진되는 현상을 보였다. 효소반응 저해제들의 영향을 조사해 본 결과 p-CMB, acetohydroxamic acid에 두 urease가 모두 강한 저해를 받았다. 두 urease의 $K_m$ 값과 $V_{max}$ 값은 E. coli(pBU11)의 urease는 $4.21{\times}10^{-2}mol/\ell$, $86.96\ell$mol/min 이었고, B. pasteurii urease는 $4.04{\times}10^{-2}mol/\ell$, $160\ell$mol/min이었다. 따라서 B. pasteurii의 urease나 그 urease gene으로 cloning되어 E. coliso에서 발현된 recombinant urease는 분자량이나 효소학적 특서에서 거의 동일한 효소단백임을 알 수 있었다.

• Parasites, Hosts and Diseases
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• 제26권4호
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• pp.239-244
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• 1988

폐홉충의 생리식염수 추출액을 항원으로 효소면역측정 법을 실시하여 특이 IgG항체 황성도를 측정하면 폐홉충중 현증 환자를 민감하고도 특이하게 감별할 수 있다. 진단에 사용하는 생리식염수 추출액은 조항원(조항원)므로 그 구성단백질중 환자 혈청내 특이항체와 반응하는 단백질항원이 어느 것인지에 패해서는 아직도 논란의 대상이 되고 있다. 조항원 중 특이항원을 정확히 판단하면 드물게 나타나는 교차반응의 기전을 이해하는데에도 도움이 될 분만 아니라 종특이 단일 단백질 항원을 제작할 수 있게 하는 데에도 기초가 된다. 이 연구는 폐홉충 성충의 생리식염수 추출액 중 폐홉충중 환자 혈청과 반응하는 단백질 분최을 관찰하기 위하 여 실시하였다. 개에 실험적으로 감염시킨지 13주째에 얻은 폐흡충 성충의 생리 식염수 추출액을 10∼15% linear gradient gel에서 환원조건하의 SDS-PAGE론 실시하였다. Coomassie염색결과 단백질 대(대) 15개를 판별할 수 있었고 그 분자량은 80, 51, 46, 45, 30, 25, 23, 21, 19, 16.5, 15.5, 14.3, 13. 12 및 10 hDa이었다. 그중 23, 16.5, 14.3, 13, 12 및 10 kDa가·진하게 염색되는 주(주) 단백질대이었다. 활동성 폐흡충증으로 확진한 환자 20명의 혈청을 효소면역전기영동이척법(immunoblot)으로 분리된 단백질대 에 반응시켰을 때에 46, 30및 23 kDa단백질에 가장 가장 강하게 반응하였다. 그 중에서도 30 kDa는 가장 많 은 환자 혈청과 반응하였고 가장 강한 반응이 나타났다. 그리고 46 kDa 및 23 kDa에서도 강한 반응이 있었다.

• 한국식품과학회지
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• 제54권4호
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• pp.422-430
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• 2022

본 연구는 통밀가루에 다량 함유되어 있는 미네랄의 체내 이용률을 높여 기능성 소재로의 응용가능성을 조사하고자 phytase와 cellulase를 처리한 통밀가루 미네랄의 체내이용률에 대하여 연구하였다. 이에 통밀가루의 최적 효소 처리 조건을 확립하기 위하여 효소농도별에 따른 이화학적 특성과 phytate 및 식이섬유소의 함량을 분석하였으며, 미네랄 강화 소재로의 이용 가능성을 확인하기 위해 머핀을 제조 후 품질특성 및 미네랄의 체내 이용률을 확인하였다. 통밀가루 건중량의 2, 10 및 20%로 2시간 동안 반응시킨 phytase와 cellulase 단일 효소처리한 시료와 20%의 cellulase/phytase를 5:5 비율로 복합 처리한 시료를 제조하였다. 효소 처리 통밀가루의 총 식이섬유소의 함량은 효소 농도에 따라 감소하였고 특히, 복합 처리군에서 가장 크게 감소하였다. 더불어 phytate 함량은 모든 효소에서 농도가 증가할수록 감소하였다. 효소처리 농도가 증가할수록 철분, 칼슘, 아연의 체내 이용률이 증가하였는데 특히, 철분의 체내 이용률은 cellulase를 처리하였을 때 약 3.3배로 가장 크게 증가하였고, 칼슘은 cellulase와 phytase를 복합으로 처리하였을 때 약 5.1배로 가장 증가하였고, 아연은 phytase를 처리하였을 때 약 2.8배로 가장 크게 증가하였다. 미네랄의 이용률이 가장 높았던 20% phytase, cellulase, cellulase/phytase 처리한 통밀가루를 이용하여 대체 비율(0, 25, 50, 75 및 100%)에 따른 머핀의 품질특성 및 미네랄 체내 이용률을 확인한 결과, 효소 처리 통밀가루로 제조한 머핀의 부피는 무처리군으로 제조한 머핀보다 대체율이 높을수록 증가하였으며, 조직감의 경우 hardness는 감소하였고, springiness와 cohesiveness는 증가하는 경향을 보였다. 그리고 효소처리 통밀가루로 제조한 머핀에서 대체 비율이 증가할수록 철분, 칼슘, 아연의 체내 이용률은 무처리군 머핀보다 증가하였는데, Cellulase 처리군의 철분 체내 이용률은 2.3배, cellulase/phytase 복합 처리군에서 칼슘은 3.7배, phytase 처리군에서 아연은 2.3배로 가장 크게 증가하였다. 이상의 결과로부터 통밀가루에 phytase와 cellulase를 처리한 후 미네랄의 이용률이 증가함을 확인하였고, 효소처리 통밀가루로 제조한 머핀의 품질의 특성이 향상되어 미네랄 이용률 증진 소재로 응용이 가능함을 확인하였다.