단백질 기능을 규명하는 단백질 구조 정보는 단백질 의약품의 약효를 증진시키고, 개발을 단축시키는데 큰 영향을 미친다. 따라서 단백질의 구조를 효과적으로 분석하기 위한 단백질 가시화에 대한 연구가 증가하고 있다. 하지만 단백질 가시화에 대한 연구가 단백질의 구조를 예측하거나 렌더링의 속도를 향상시키는 것을 중심으로 이뤄지고 있으며, 단백질 가시화 형태에 따른 정보 전달 효용성에 대한 연구는 미비한 실정이다. 본 연구는 단백질 의약품에 대한 효율적인 정보 서비스의 사전 연구로써 단백질 1, 2차구조 혼합가시화 형태별 정보표현적합도를 분석하였다. 단백질 1, 2차구조 혼합가시화 형태는 대표적 가시화 서비스인 Chimera, PDB, Cn3D와 기존 가시화 서비스의 문제점을 개선한 단백질 1, 2차구조 혼합가시화 형태를 대상으로 하였다. 정보표현적합도를 구하기 위한 정보요인은 피험자 분석 결과를 바탕으로 단백질 1차구조, 아미노산 위치, 단백질 2차구조, 단백질 2차구조 비율정보로 구분하였으며, 피험자는 단백질 의약품 업계종사기간이 5년 이상인 전문가 집단을 대상으로 하였다. 그 결과 단백질 1, 2차구조 혼합가시화형태별 정보표현적합도에는 유의미한 차이가 있었으며, 가시화 형태별 정보 전달 효용성에 차이가 있음을 입증할 수 있었다.
본 실험은 효용성이 넓어지고 있는 바이오의약품 시장에서 질량분석기를 이용한 정밀 분석법을 제시한다. 단백질 의약품인 인성장호르몬(Somatotopin)을 분석하는 다양한 기술 중, 생화학적 시료 전처리를 통해 펩티드화 시킨 단백질을 LC-MS/MS 분석법으로 분석하였다. 분석과정은 액체크로마토그래피를 이용한 분리분석과 질량분석을 이용한 MS 및 MS/MS 분석으로 수행하였다. 인성장호르몬의 경우 21개의 트립틱 펩티드로 절단할 수 있는데, 본 실험을 통해 이들 중 13개의 펩티드가 평균 1 ppm 에러 이내로 이론적 예측치와 일치하였다.
최근 특별한 기능을 갖는 단백질의 수요가 늘어남에 따라 단백질의 기능성을 개량하려는 연구가 활발히 이루어지고 있다. 이들 중 대표적인 것이 단백질을 단백질 분해효소로 처리한 가수분해물을 환자의 영양강화제와 같은 의약품이나 기능성이 요구되는 식량소재로서의 이용이다. 단백질의 효소적 가수분해에 있어서 회분식 공정은 장치가 간단하고 조작이 단순하며, 고 농도의 기질을 사용할 수 있지만 많은 양의 효소가 필요하며 높은 에너지와 노동력이 요구된다. 그리고 최종생성물의 저해작용으로 인해 수율이 적고 최종생성물의 기능적인 성질을 조절할 수 없는 단점이 있다.
재조합 생물의약품 생산시, 오염물질의 유래는 외인성(외래성 바이러스, 마이코플라즈마, 미생물) 및 내인성(생산세포주 유래 단백질) 두 가지의 일반적인 가능성으로 존재한다. 이 중 생산세포주 유래의 불순 단백질은 환자에게 면역이상반응을 일으킬 수 있어 제품의 안정성과 사용자의 안전상의 문제가 될 수 있다. 따라서 이들 단백질의 오염 여부를 검출하는 방법의 개발이 요구된다. 상용화된 분석제품들은 일반적인 생산세포주 유래 단백질에 대한 분석은 가능하지만, 생산 방법이나 재조합 된 세포의 특성에 따라 달라질 수 있는 고유한 생산세포주 유래 단백질에 대한 분석은 적합하지 못하다. 본 연구에서는 재조합 항체의약품 생산과 정제과정에서 목적단백질의 생산 유전자를 지니지 않는 null cell mock 배양에 의해 생산세포주 유래 모든 단백질을 얻어 이에 대한 다클론항체를 제작하여 면역학적 반응을 이용하여 생산세포주 유래 단백질을 정량 할 수 있는 ELISA 방법을 개발하였다. 생산세포주 유래 단백질에 대한 다클론항체는 rabbit에서 얻었으며, 이 중 생산세포주 유래 단백질에 특이적인 항체만을 정제하였다. 또한 direct sandwich ELISA 방법 개발을 위해 항체에 발색효소(HRP)를 표지하였다. 이렇게 만들어진 항체를 이용하여 정성분석을 위한 Western blot과 정량분석을 위한 ELISA 방법을 개발하여 목적단백질의 정제과정 내에서 생산세포주 유래 단백질이 제거되는 것을 확인하였다. 또한 개발된 ELISA 방법은 ICH 규정에 따라 validation을 실시한 결과 되어 객관적 검증을 받은 결과, 특이성, 직선성, 정확성, 정밀성의 기준을 만족하며 검출한도가 10.8 ppm인 방법임을 확인하였다.
단백질의 구조적 동등성을 평가를 위한 형태 기반의 기술자에 대한 연구는 제한적으로 이루어지고 있으며 대부분 지역적 특성 값으로 표현된 지역적 접근 방법이 다수를 이루고 있다. 지역적 특성과 전역적 특성을 포함하는 형태기술자의 경우 각 특성들이 동등한 중요도로 결합되어 있다. 본 연구에서는 선형 회귀분석을 적용하여 각 특성에 대한 중요도를 최적화하여 형태기술자를 재정의 하였다. 최적화된 형태기술자를 단백질의약품인 인슐린 모델에 적용하여 구조적 동등성을 평가할 수 있는 방법론을 제시하였다. 최적화된 형태기술자는 동일한 그룹에 속한 인간 인슐린 단백질 모델과 지역적으로 다른 구조를 가지는 인슐린 아날로그 그룹을 명확히 구분할 수 있음을 확인하였고 이러한 성능은 이전 연구의 형태기술자와 3D 저니크 기술자보다 더 좋은 성능을 보였다. 또한 제안한 방법은 고해상도 단백질 3차 구조 정보를 활용하여 유사성을 판별한 RMSD 방법과 유사하게 서로 다른 표면 구조를 가지는 단백질을 구별할 수 있음을 확인하였다. 이러한 결과로부터 본 연구에서 제시하는 형태기술자 및 최적화된 동등성 평가 함수는 SAXS 분석과 같이 저해상도 단백질 표면 모델을 확보할 수 있는 분석에 적용하여 단백질의 구조적 동등성을 판별할 수 있는 기반을 제공할 수 있을 것으로 판단된다.
대한적십자사 혈장분획센터는 국민들의 헌혈을 통해 수집된 혈장으로 부터 단백질을 분획해 알부민, 면역글로불린 등의 원료가 되는 혈장분획제제를 생산 공급하는 전담 기관이다. 이들 의약품이 혈우병, 간경변증, 무감마그로불린혈증, 가와사키병 등 각종 질병의 치료에 쓰인다는 점을 감안하면, 사실상 이곳은 국민생명보호의 최일선 현장이라고 할 수 있다. 때문에 이곳은 그동안 '국민건강의 핵심시설' 또는 '국가보건인프라의 중추' 등으로 불려왔다. 이처럼 의료 및 보건분야의 중요시설로 알려진 이곳이 최근 특이하게도 '전국 최고의 안전사업장'으로 유명세를 치르고 있다. 깐깐하기로 유명한 위험성평가 우수사업장 인정 심사를 만점에 가까운 접수로 통과한 것이 그 배경이다. 이곳이 이처럼 안전명가의 반열에 올라설 수 있었던 비결은 무엇일까. 이에 대한 해답은 현재 센터를 이끌고 있는 신창우 원장에게서 찾을 수 있다. 그는 안전보건과 관련된 일이라면 무엇이든 앞장서고, 실무자들에 대해 전폭적인 지원을 아끼지 않고 있다. 국민의 소중하고 고귀한 혈액을 기반으로 의약품을 만드는 곳이기에, 단 한 방울의 혈액도 낭비되는 일이 없도록 철저한 안전관리를 펼쳐야 한다고 말하는 그를 만났다.
최근 광우병 파동과 프리온 단백질의 전염으로 인하여 발생되는 것으로 알려진 크로이츠펠트 야콥병에 대하여 폭넓게 연구되면서 생화학계에서 프리온 단백질에 대한 관심은 상당하다. 본 연구에서는 프리온 단백질의 일부분인 PrP 106-126의 마이크로 몰농도 단위의 정량분석을 실시하였다. 본 연구에서 플로래스카민은 일차 아민과 반응하여 형광을 띠는 물질로써, 알파이미저는 형광의 세기를 측정하는 기기로써 사용되었다. 따라서 합성된 PrP 106-126으로 플로래스카민과 알파이미저를 이용하여 마이크로 몰농도단위의 정량 분석을 위한 조건을 정립하였으며 이를 통하여 표준곡선을 얻을 수 있었다. 이 방법은 차후 변형 프리온 단백질에 대한 응집저해제 및 의약품 연구에 큰 기여를 할 것이다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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