This paper presents a new method and an associated device, capable of detecting protein presence and size from the shift of the mechanical stiffness changing points due to the presence and size of proteins in a nano-gap actuator. Compared to the conventional resonant detection method, the present nanomechanical stiffness detection method shows higher precision for protein detection. The present method also offers simple and inexpensive protein detection devices by removing labeling process and optical components. We design and fabricate the nanomechanical protein detector using an electrothermal actuator with a nano-gap. In the experimental study, we measure the stiffness changing points and their coordinate shift from the devices with and without target proteins. The fabricated device detects the protein presence and the protein size of 14.0$\pm$7.4nm based on the coordinate shift of stiffness changing points. We experimentally verify the protein presence and size detection capability of the nanomechanical protein detector for applications to high-precision biomolecule detection.
Paenibacillus는 호기성의 내생포자를 형성하는 그람양성균으로써 이전에는 Bacillus로 분류되었다. Paenibacillus sp. CK214 균주는 LB agar 평판배지에서 높은 swarming 운동 능력을 가지고 Paenibacillus 특유의 집락 형태를 나타내었지만 glucose가 첨가된 평판배지에서는 운동 능력을 상실하였다. 투과전자현미경(TEM)을 이용하여 glucose 조건에 따른 CK214 균주의 편모를 관찰하면 LB agar 평판배지에서 배양한 CK214 균주는 주모성의 편모를 가지는 반면 glucose를 첨가한 평판배지에서 배양한 CK214 균주의 경우 주모성 편모가 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었다. 물리적 충격과 원심분리를 통해 분리한 CK214 균주의 filament 구성 단백질을 SDS-PAGE를 통해 확인하였으며, 약 29 kDa 크기의 단일 단백질 밴드가 나타났다. Edwardsiella tarda 균주의 flagellin 단백질에 특이적인 항체를 이용한 immunoblotting 수행 결과, 이 단일 단백질 밴드는 flagellin 단백질임이 확인되었다. Glucose조건에 따른 CK214 균주의 flagellin 단백질의 발현을 단백질 수준에서 관찰한 결과, glucose가 첨가된 조건에서 생장한 CK214 균주에서의 flagellin 단백질 발현이 glucose가 없는 조건일 때에 비해 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
회화 문화재의 표장 및 보존처리에 쓰이는 풀은 그 문화재의 수명을 좌우할 정도로 중요하기 때문에 옛날부터 풀의 제조법에 관한 연구가 있어 왔고, 이에 대한 기록이 남겨져 왔다. 기록들을 종합해 보면, 대부분 풀의 제조법에 있어 소맥의 단백질을 제거하는 것에 대한 연구가 행해졌음을 알 수 있다. 이렇게 공통적으로 보여지는 단백질 제거는 단백질이 풀에 있어서 유익하지 못한 요소를 갖고 있다는 것이었다. 실제로 단백질 함유량에 따른 굴의 접착력과 보존성의 변화에 대한 실험을 해 보았는데, 그 결과를 종합해 보면, 미생물의 영양원인 단백질의 함량이 적을수록 접착력과 보존성은 좋아지지만, 유연성은 떨어졌다. 그러나 단백질의 함량이 적으면 적을수록 룰의 보존성은 좋아지기 때문에 회화 문화재 보존처리에 쓰여야 하는 풀은 보존성이 있고, 최소한의 농도로 최대한의 접착력을 지닌 또, 가역성이 있는 소맥 전분풀이었다.
두유에서 발생되는 비지와 대두의 일반성분과 단백질의 추출률을 비교하기 위해 시간, 온도, pH별로 분석하였고, 단백질 분자들 사이의 상호작용에 관여하는 물질 urea, SDS, 2-mercaptoethanol를 사용하여 비지단백질의 insolubilization mechamism을 조사하였다. 또한 enzyme modification으로 기능성을 향상시켜 식품소재로서의 이용 가능성에 대해 분석하였다. 비지와 대두는 각각 37.3%, 42.5%의 단백질을 함유하고 있으며 비지는 생산공정 증의 과도한 열처리에 의하여 극히 낮은 용해도를 나타냈다. 비지단백질의 낮은 용해도는 주로 disulfide bonding에 의한 cross linking에 기인하는 것으로 밝혀졌다. 비지단백질과 대두단백질은 pH 3, pH 4에서 가장 낮은 용해도를 보였다. Carbohydrase와 protease를 첨가하여 단백질의 추출츌을 비교한 결과는 비지와 대두는 carbohydrase에서 미세한 반응을 보여 단백질의 용해도에 큰 영향을 주지 못하였으나 여러 protease 가운데 Alcalase는 비지단백질의 용해도를 급격히 증가시켰다.
Poly(ethylene glycol) (PEG)는 Hydrophilic하면서 독성이 없기 때문에 약물과 관련된 연구가 많이 이루어졌다. 초기 PEGylation은 약물과 관련된 연구가 주를 이루었지만, 최근에는 PEG의 non-fouling 효과 때문에 표면에 적용하여 biomedical 장비에 세포나 단백질이 붙지 않도록 하는 개질하는 방법에 많은 연구가 진행되고 있다. Native Chemical Ligation(N.C.L.)은 단백질을 합성할 때, Protecting group을 사용하지 않고 반응을 진행시킬 수 있기 때문에 많은 주목을 받고 있다. N.C.L.은 합성한 두 물질이 Thioester와 Cysteine을 갖고 있으면, mild condition에서 amide bond를 형성하면서 반응이 쉽게 진행되기 때문에 다양한 분야에 적용할 수 있다. 이 논문에서 우리는 N.C.L.을 표면에 적용시켰으며 그 중 한 예로 표면 PEGylation진행하였다.
무우에 함유된 allylisothiocyanate의 첨가가 Aspergillus parasiticus R-716의 배양시 sterigmatocystin, 지질, 단백질, RNA, citrate 및 AMP 등의 각종 대사산물의 생합성에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과 aflatoxin의 전구체인 sterigmatocystin의 함량은 배양 48시간 후에는 50ppm allyli-sothiocyanate 첨가구가 대조구보다 낮게 나타난 반면, 144시간째부터는 첨가구가 대조구보다 오히려 높게 나타났다. Allylisothiocyanate의 첨가로 Aspergillus parasiticus R-716의 배양액에서 citrate는 높은 함량을 나타내었으며, 또한 균체내 지질, 단백질, RNA의 함량은 높게 나타났으나 AMP 함량은 낮았다.
배양 중의 골격근 세포는 증식을 거쳐 세포융합을 통해 다핵세포로 분화되므로 세포분화의 연구에 좋은 모델로서 이용되고 있다. 이전 실험에서 근원세포 융합을 억제하는 단일클론항체(MII-3J31)가 제작되었으며(Kim et al., 1992)이 항체에 대한 항원은 분자량이 약 35 kDa인 세포막 단백질로 추정되었다. 본 실험에서는 13일 계배와 성체의 근섬유 mRNA에서 CDNA라이브러리를 제작하여 근원세포 분화에 특이적으로 나타나는 유전자를 추적하였다. 근원세포 융합에 관여하는 단백질에 대한 CDNA는 계배 13일 째의 근원세포 CDNA라이브러리에서 단일클론항체를 사용한 immunoscreening 방법을 이용하여 확인하였다. 이 CDNA의 크기는 약 1.5 kb였다. 한편 13일 계배와성체 근섬유 CDNA 라이브러 리를 이용하여 13일 계배에만 특이하게 유전자 발현 이 일어 나고 성체에서는 나타나지 않는 약 0.8 kb의 CDNA플 찾았다.
콩의 주요 저장 단백질인 glycinin의 라이신 잔기를 적당량의 acetic anhydride를 이용하여 28, 65, 85, 95%로 아세틸화시켰다. 아세틸화에 의한 구조적 변화를 solvent perturbant 방법으로 측정한 결과 자연상태의 단백질에 있어서는 타이로신 잔기의 약 40% 미만이 단백질 표면에 노출되어 있었으나 85% 아세틸화 glycinin에 있어서는 70% 이상이 표면에 노출되어 용매에 대해 접근이 용이하게 되었다. 이와 같은 현상은 second derivative spectroscopy에 의해 서로 동일하게 나타났으며, 따라서 아세틸화에 의해 타이로신과 같은 소수성 아미노산이 단백질 표면으로 이동하여 단백질 구조가 변형되었음을 알 수 있었다. 한편 near UV circular dichriosim의 결과 자연상태의 glycinin과 아세틸화가 일어난 glycinin 모두 유사한 모양의 spectra를 나타내었으나 95% 아세틸화 glycinin의 경우에는 tryptophan의 영향이 두드러졌다. Specific viscosity의 경우 아세틸화가 일어날수록 급격히 증가하였는데 이는 아세틸화에 의해 구형의 glycinin이 변형되어 분자의 부피가 커졌을 뿐 아니라 subunit의 분리에 의해 입자수가 증가했기 때문이다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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