• Investigative Magnetic Resonance Imaging
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• 제16권1호
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• pp.47-54
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• 2012

목적: 백서 중간엽 줄기세포에 페리틴 유전자를 형질 도입시켜 생물학적 특성의 변화 유무를 평가하고, 자기공명영상에서 신호강도의 차이를 확인해보고자 하였다. 대상과 방법: 백서 중간엽 줄기세포에 렌티바이러스를 이용하여 사람유래 재조합 페리틴과 녹색형광단백질 유전자의 과발현을 유도하였다. 페리틴 유전자가 발현된 백서 중간엽 줄기세포의 증식성과 생존능을 분석하기 위해 MTT 어세이를 수행하였으며, 유세포 분석을 수행하여 중간엽 줄기세포의 표면 마커 발현을 평가하고, 세포 내 철 함량을 측정하고 프러시안 블루 염색을 시행하여 철 축적능력을 분석하였다. 세포 팬텀을 이용하여 9.4 T 자기공영영상 기기를 이용하여 검출가능성을 평가하였다. 결과: 페리틴과 녹색형광 유전자는 백서 중간엽 줄기세포에서 안정적으로 발현되었다. 페리틴 유전자의 과발현으로 인해 백서 중간엽 줄기세포의 생물학적 특성 (증식능력, 생존능, 표면마커)은 영향을 받지 않았다. 페리틴을 발현하는 중간엽 줄기세포에서 철의 축적능력이 증가된 것이 확인되었고, T2 이완 시간은 유의하게 감소하였다. 결론: 줄기세포 치료 연구에서 자기공명 리포터 유전자 페리틴은 자기공명영상법을 이용하여 중간엽 줄기세포를 비침습적으로 가시화 할 수 있고 이를 이용하여 생체추적이 가능할 것으로 기대된다.

• Nuclear Medicine and Molecular Imaging
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• 제41권3호
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• pp.226-233
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• 2007

목적: 광학과 핵의학 및 자기공명 분자영상 기술은 생체내에서 리포터 유전자의 발현을 비침습적으로 평가할 수 있다. 한가지 이상의 유전자 발현을 영상화 할 수 있는 복합분자영상은 유전자의 발현과 유전자 치료 후 효능의 평가를 다양한 방법으로 반복하여 평가할 수 있다는 장점이 있다. 본 연구에서는 핵의학 영상이 가능한 NIS와 광학 영상이 가능한 EGFP 두가지 유전자를 동시에 발현하는 HepG2-Retro-PNRGW (PGKp-NIS-RSVp-EGFP-WPRE) plasmid를 이용한 간암 세포주(HepG2-NE)를 구축하고, NIS와 EGFP 리포터 유전자의 기능 발현을 체내에서 광학영상과 핵의학 영상으로 확인하고자 하였다. 재료 및 방법: pcDNA-NIS로 부터 NIS 유전자를 분리하여 pRetro-PN vector를 만든 후, pLNRGW (LTR-NeoR-RSV-EGFP-WPRE)로부터 RSV-EGFP-WPRE 조각을 분리하여 최종적으로 NIS와 EGFP 유전자가 동시에 발현할 수 있는 pRetro-PNRGW vector를 구축하였다. 구축된 vector를 이용하여 Retro-PNRGW retrovirus를 생산하였으며, 이를 HepG2 세포에 감염시켜 HepG2-NE 세포주를 만들었다. 이 세포주의 NIS 유전자의 발현은 역전사효소 중합효소 연쇄반응으로 mRNA 발현을 확인하였고, EGFP 유전자의 발현은 형광현미경을 통하여 EGFP 단백질이 발현하는 녹색형광을 관찰함으로써 확인하였다. 이중 리포터 유전자 중 NIS 유전자의 기능은 세포에서 방사능 옥소의 섭취량과 유출량의 측정을 통해서 확인하였다. 이렇게 만들어진 세포를 누드마우스에 이식하여 형광 영상, I-123을 이용한 감마카메라 영상과 I-124를 이용한 소동물용 PET 영상을 획득하였다. 결과: NIS와 EGFP의 이중 리포터 유전자를 가지고 있는 HepG2 세포주가 성공적으로 만들어졌다. 세포의 약 50% 정도가 형광 현미경 아래에서 관찰되었다. NIS 유전자의 발현은 역전사효소 중합효소 연쇄반응 실험을 통해서 확인하였고, NIS가 발현된 세포의 방사능옥소 섭취량은 대조군에 비하여 약 9배 정도 높게 나타났다. 방사능옥소 유출량 실험에서는 약 9분에 반 정도의 옥소가 유출되는 것이 확인되었다. 구축된 세포주를 이식한 후 획득한 형광 영상, 감마카메라과 소동물용 PET 영상에서는 반대쪽의 대조군 세포를 이식한 것에 비하여 뚜렷한 형광신호가 보였고, 더 높은 방사능옥소 섭취가 확인되었다. 결론: NIS와 EGFP의 이중 리포터 유전자를 가지는 간암 세포주가 성공적으로 구축되었고, 소동물에서 두 유전자를 각각 치료용 리포터 유전자와 영상 리포터 유전자로의 사용이 가능할 것이라고 생각된다.

• 한국발생생물학회지:발생과생식
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• 제11권2호
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• pp.111-119
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• 2007

배아줄기세포는 외부 기인 특정 요소를 이용한 세포 조절물질 활성을 통하여 원하는 세포형태로 분화될 수 있다. 배아줄기세포의 이용성세포침투성단백질(CPP)은 몇 개의 아미노산으로 구성된 작은 펩타이드로 유용한 물질 수송계 중의 하나로 인식되고 있다. 본 연구에서는 몇 종류의 CPP를 이용하여 특정 단백질을 생쥐배아줄기세포(R1)내로 트렌스펙션하는데 있어 그 정도를 결정할 수 있는 요소들의 영향을 분석하였다. CPP인 Buforin II, pEP-1을 강도를 강화한 녹색형광단백질(EGFP)에 부착되도록 하여 살아있는 세포에서 볼 수 있도록 하였다. 다양한 시간대별로 그리고 다양한 농도로 재조합 CPP-EGPF를 생쥐 배아줄기세포에 처리하였으며, 대조군으로 사용한 EGFP는 CPP를 갖고 있지 않았다. 재조합 CPP-EGFP들이 R1 배아줄기세포에 미치는 세포독성은 CPP 종류와 재조합 CPP-EGFP 농도에 의존적이었다. CPP-EGFP가 배아줄기세포의 세포질이나 핵질로 들어간 증거는 처리 후 30분 이내에서는 찾을 수 없었다. 1시간 후, pEP-1-EGFP-N을 처리한 일부 세포에서만 형광단백질이 세포안으로 들어간 것을 발견할 수 있었다. 처리를 24시간까지 하였으나 흥미롭게도 세포안으로 들어가는 정도와는 비례관계가 없었다. 또한, 배아줄기세포의 막을 통과할 수 있는 CPP의 경우, 처리 농도는 세포막을 침투하여 세포내로 이동하는 것과 비례적 관계는 없으나, 매우 높은 농도에서 약간 증가하는 경향을 보였다. 요약하면, CPP-EGFP의 트렌스펙션 효과는 전적으로 CPP에 의존적이며, CPP에 따라서는 His tag의 위치 또한 트렌스펙션에 영향을 줄 수 있으며, 처리시간은 CPP를 이용하여 배아줄기세포내로 단백질을 수송하는데 있어 중요 변수가 아니다. 또한, CPP-EGFP의 농도는 배아줄기세포막을 가로질러 수송되는데 큰 영향을 주지 않았다. 앞으로의 연구에서, 이들 CPP의 변형 또는 매개자 개발을 통한 배아줄기세포에서 좋은 단백질성 매개 수송자를 만드는 것이 필요하며 이를 이용한 분화 유도는 매우 유용할 것으로 사료된다.

• 접착 및 계면
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• 제17권4호
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• pp.149-154
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• 2016

일반적으로, 화학 물리적 변성이 수반되는 멸균방법을 적용하지 못하는 경우 필터여과에 의한 멸균 방법을 주로 사용한다. 하지만 바이러스의 경우 100 nm의 작은 크기로 인해 박테리아 제거에 사용되는 필터여과에 의한 멸균 방법을 적용하기가 어렵다. 본 논문에서는 화학 물리적 변성 없이 바이러스를 비활성화하는 물질 개발을 위하여, 카테콜기가 도입된 헤파린 고분자(Hep-C)를 합성하였다. Hep-C의 바이러스 비활성화 효과를 알아보기 위해서 표면이 노르에피네프린으로 코팅된 조직배양접시에 아데노연관바이러스(Adeno-associated virus; AAV)를 고정화하였으며, 그 위에 다시 Hep-C를 코팅하여 녹색형광단백질(GFP) 유전자를 전달할 수 있는 AAV의 비활성화 정도를 유세포분석기(FACS)를 이용하여 분석하였다. 그 결과 AAV에 Hep-C를 도포하면 99%에 달하는 비활성화 효과를 보였으며, 헤파린 고분자를 도포한 결과에 비해 강한 염 저항성을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로 미루어 보아 제조된 Hep-C는 AAV 바이러스 제거의 효과적 방법으로 충분한 가능성을 가짐을 증명하였다.

• 한국정보통신학회:학술대회논문집
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• 한국정보통신학회 2018년도 춘계학술대회
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• pp.588-591
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• 2018

Baculovirus는 원래 알팔파 루퍼 (looper)로부터 분리되었으며 154 개의 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 가진 134-kbp 게놈을 포함하고 있다. 주요 캡시드 단백질 VP39는 약간의 단백질과 함께 p6.9 단백질로 DNA를 감싸는 뉴클레오 캡시드($21nm{\times}260nm$)로 형성된다. 그것들은 막대 모양의 캡시드 안에 이중 가닥의 고리 모양의 슈퍼 코일 DNA 분자이다. 야생형 baculovirus는 용균 및 폐색 된 생명주기를 모두 나타내며 바이러스 복제의 3 단계에 걸쳐 독립적으로 발달한다. 재조합 baculovirus는 광범위한 포유류 세포 유형에서 벡터를 전달하고 재조합 단백질을 발현 할 수 있다. 특히, 이들 baculovirus 벡터에 우세한 선별 마커를 포함시킴으로써 많은 세포에서 다양한 재조합 유전자를 발현시킬 수 있다. 본 연구의 배큘로 바이러스 벡터는 cytomegalovirus (CMV) 프로모터, uroplakin II promoter, polyhedron promoter, 수포 구내염 바이러스 G (VSVG), 녹색 형광 단백질 (EGFP), 단백질 전달 도메인 (PTD) 유전자 등으로 재구성되었다. 이러한 재구성 된 벡터를 다양한 세포 및 세포주에 감염시켰다. 우리는 다른 재조합 벡터와 비교하여 이러한 재조합 벡터의 전이 및 발현을 조사하는 수행하였다. 본 연구에서, 우리는 이 재조합 벡터의 형질 감염 및 발현이 어떤 대조군 벡터보다 더 높은 효능을 갖는다는 것을 알았다. 본 연구는 과학 기술부, 한국 정보 기술 진흥 기금 (MSIP)이 후원하는 한국 연구 재단 (NRF)을 통해 중견 연구원 프로그램 (NRF-2016R1A2B4016552)을 통해 지원되었다.

• Tuberculosis and Respiratory Diseases
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• 제59권1호
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• pp.30-38
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• 2005

연구배경 : Arsenic trioxide($As_2O_3$, 비소 삼산화물)는 급성전 골수성백혈병의 효과적인 치료제로 이용되고 있고, 비소세포폐암을 비롯한 여러 고형종양세포에서 세포 고사를 유도하나 백혈병에 비해 상대적으로 높은 농도가 필요하여 실제적인 치료에 제한이 있어왔다. Sulindac은 COX-2 억제, 암세포 성장의 억제 및 세포 고사 유도를 기전으로 하는 항암효과가 있고, 다른 화학요법이나 방사선치료의 반응성을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 저자들은 NCI-H157 폐암세포주에서 $As_2O_3$와 sulindac의 병합요법이 Fas/FasL 신호전달계의 활성화와 caspase 단백질 활성화 의해 세포고사가 유도되었음을 보고한 바 있다. 이 연구의 목적은 이러한 경로 이외에 다른 기전유무를 밝히는데 있다. 방 법 : 세포 독성은 MTT 방법으로 구하였고, HRP 방법을 이용해 ROS를 직접 측정하였다. 세포고사의 형태학적 특성을 보기위해 핵산염색과 관련된 단백질의 발현을 확인하였다. 또한 미토콘드리아의 기능변화를 보기 위해 미토콘드리아의 막전위차를 측정하였고, anti-cytochrome c와 Bcl-2 family 단백질들의 발현 양상을 western blotting을 통해 관찰하였다. 결 과 : 단독요법에 비해 병합요법시에 생존율의 의의 있는 감소를 보였다. 이러한 생존율은 항산화제를 전처리 한 경우 농도 의존적으로 회복됨을 관찰할 수 있었다. ROS의 생성은 병합요법시에 대조군에 비해 의의 있게 증가하였고, 이러한 현상은 항산화제 전처리군에서 감소된 소견을 보였다. 또한 병합요법시 핵산염색에 의해 여러조각의 분절된 형광절편과 caspase 3, PARP의 활성을 통해 세포고사가 유도되었음을 확인하였고, 항산화제 전처리군에서 상쇄됨을 관찰하였다. JC-1 염색 후 형광현미경을 통한 미토콘드리아 막전위차에 미치는 영향은 병합처리군에서 녹색형광으로의 변화가 보였고 항산화제 전처리군에서 소실됨을 확인하였다. 또한 병합요법시의 cytochrome c의 세포 질내의 증가와 미토콘드리아내의 감소가 관찰되었고, Bax의 증가, Bid와 Bcl-xL의 발현감소를 확인할 수 있었으며 이러한 현상은 항산화제 전처리군에서 소실됨을 보였다. 결 론 : NCI-H157 폐암세포주에 $As_2O_3$와 sulindac의 병합 요법은 ROS생성과 미토콘드리아 기능변화를 통해 세포고사가 유도되었다.

• 한국가금학회지
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• 제32권4호
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• pp.225-229
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• 2005

현재 가장 활발하게 진행되고 있는 형질전환 자 생산 연구방법은 배반엽단계 수정란에 농축한 virus를 주입하여 모자이크 형태의 $G_0$ 형질 전환체를 생산하고 이들을 이용하여 $G_1$ 형질전환 후대를 생산하는 방법이 가장 보편적으로 이용되고 있다. 상기의 연구방법은 완전한 형질 전환체를 획득하기 위해서는 수천수의 $G_1$을 생산하고 각각 유전분석을 수행하는 문제점을 가지고 있다. 이러한 문제점을 개선하고자 다음의 연구를 계획하고 수행하였다. 20nL의 농축된 GFP retrovirus를 1세포기 수정란에 주입하고, 주입한 유전자의 발현율과 수정란의 생존율을 배양 4일차 수정란에서 GFP의 발현과 배자의 생존 여부로 판정하였다. 연구결과는 배양 4일차 수정란의 생존율은 기존의 naked DNA 미세주입방법에 비해 다소 낮은 것으로 나타났으나 유의성은 없었다. 1세포기 수정란은 배반엽 단계 수정란과 달리 주입한virus의 유전자를 발현하지 않는 것으로 관찰되었다. 연구결과는 배반엽단계 수정란에 virus 미세주입 방법이 형질전환 닭 생산에 가장 효율적인 방법임 보여주고 있다.

• 한국정보통신학회:학술대회논문집
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• 한국정보통신학회 2019년도 춘계학술대회
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• pp.533-536
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• 2019

재조합 배큘로 바이러스는 배양 된 곤충 세포에서 이종 유전자를 발현하는데 널리 사용된다. 재조합 배큘로 바이러스는 광범위한 포유류 세포 유형에서 재조합 단백질의 발현을위한 유전자 전달 벡터로서 작용할 수있다. 바큘로 바이러스 시스템은 안전성, 대규모 및 높은 수준의 유전자 발현 관점에서 중요한 이점을 갖는다. 본 연구에서는 pOPINEneo-3C-GFP 벡터로부터 재구성 된 바큘로 바이러스 벡터를 사이토 메갈로 바이러스 (CMV) 프로모터, 강화 된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 및 p53과 NcoI 및 XhoI로 재조합시켰다. 이러한 재조합 벡터를 다양한 세포 및 세포주에 감염시켰다. 이와 같이 개발 된 바큘로 바이러스 벡터는 재조합 유전자의 전이 및 발현을 통상적 인 벡터와 비교하여 분석 하였다. 이러한 결과는 바큘로 바이러스 벡터가 대조군 벡터보다 전이 및 전이에서 더 높은 효율을 갖는다는 것을 시사한다. 본 연구는 과학 기술부, 한국 정보 기술 진흥 기금 (MSIP)이 후원하는 한국 연구 재단(NRF)을 통해 중견 연구원 프로그램 (NRF-2016R1A2B4016552)을 통해 지원되었다.

• 한국작물학회지
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• 제65권2호
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• pp.113-123
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• 2020

본 논문은 과산화수소 엽면 처리를 통해 수수에서 한발 스트레스 완화 효과가 있는지 알아보기 위하여 과산화수소 처리에 따른 생육 및 생리적 특성 변화와 단백질 변화를 분석하였다. 1. 포장 실험에서 한발 스트레스는 수수 생장을 감소시켰으나, 과산화수소 처리구에서는 과산화수소 무처리구보다 생육이 우수하였다. 또한 한발 조건에서 과산화수소 처리는 무처리에 비해 수량 관련 형질들의저하를 막는 효과를 보였다. 2. 엽 녹색도(SPAD) 및 엽록소 형광(Fv/Fm), 광합성 형질 조사에서 과산화수소 처리가 과산화수소 무처리보다 높았고, 포장 실험에서 엽내 과산화수소 함량은 적습+H₂O₂ 처리가 적습+H₂O 처리보다 과산화수소 함량이 227.8 µmol·g^-1 높았고, 한발 조건에서 엽내 과산화수소 함량은 한발+H₂O₂ 처리가 한발+H₂O 처리보다 16.7 µmol·g^-1으로 낮았다. 3. 한발 조건에서 과산화수소 처리는 여러 단백질의 발현을 변화시켰으며, 특히 광합성 관련 단백질인 ATP synthase deltal chain, cytochrome b6-f complex iron-sulfur subunit, ATP synthase subunit gamma, putative uncharacterized protein Sb02g002690, Sb07g027500와 Superoxide 라디칼을 제거해주는 superoxide dismutase가 증가한 것을 확인하였다. 그리고 단백질 보호와 복원에 관련된 heat shock protein의 발현 증가도 확인되었다. 종합적으로 과산화수소 엽면 처리가 한발 하에서 광합성 관련 단백질의 발현을 증가와 기공 개도를 높여 광합성 능력을 향상시켰다. 특히 엽내에 축적될 수 있는 활성산소종을 제거하는 항산화 능력이 높아져 한발 스트레스 대한 내성을 높여 수수의 생육과 수량성 저하가 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

• 생명과학회지
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• 제24권10호
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• pp.1039-1045
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• 2014

본 연구의 목적은 마우스 레이디히 세포인 mLTC-1 세포에 사람 융모성 성선자극호르몬인 hCG를 처리하여 유도되는 소포체 스트레스가 IRE1/XBP1 경로를 통하는지 분석하는 것 이다. 이전 연구에서 hCG처리에 의해 레이디히 세포는 소포체 스트레스 매개의 세포자멸사가 유도될 뿐만 아니라 ATF6경로를 조절함으로써 UPR이 성호르몬 합성효소의 발현에 중요한 역할을 하는 것을 증명하였다. UPR 경로는 또한 IRE1/XBP1 경로를 통하여 조절되는 것이 알려져 있지만 레이디히 세포에서 hCG에 의한 소포체 스트레스에 의해 IRE1/XBP1 경로의 활성화가 유도되는지에 대해서는 거의 알려져 있지 않다. mLTC-1세포에서 hCG 처리 후 IRE1/XBP1경로의 활성을 조사하기 위하여, 인산화된 IRE1 단백질 확인하기 위한 western blot, XBP1 mRNA splicing 확인하기 위한 RT-PCR을 수행하였다. 또한 우리는 IRE의 활성을 관찰하기 위하여 소포체 스트레스-활성 표지자(ERAI) construct를 이용하고 이를 형광현미경과 flow cytometry를 이용하여 분석하였다. 결과적으로, hCG 처리에 의해 인산화된 IRE1 단백질의 발현 수준이 두드러지게 증가하였다. F-XBP1-venus/F-$XBP1{\Delta}DBD$-venus가 도입된 mLTC-1 세포에서, hCG 처리에 의해 녹색 형광을 띄는 세포들이 유도되었고 각각 핵/세포질에서 발현하는 것을 확인할 수 있었다. 게다가 hCG 처리 후에 XBP1 mRNA의 splicing 또한 상당히 증가되는 것을 확인 할 수 있었다. 이 결과들을 통하여 종합해 볼 때 레이디히 세포에서 hCG 처리에 의해 유도되는 소포체 스트레스가 IRE1/XBP1 경로의 활성을 유발하는 것을 확인 할 수 있었다.