본 연구는 꾸지뽕 나무 열매로부터 75 kDa의 당단백질(꾸지뽕 당단백질)을 추출한 후 꾸지뽕 당단백질의 첨가에 따른 알레르기성 염증 인자인 histamine 유리 억제능력 및 COX-2의 활성 억제 효과를 평가하였다. RBL-2H3세포를 22시간 동안 IgE로 감작시킨 후, HSA를 처리하여 histamine의 유리양을 측정한 결과 꾸지뽕 당단백질을 처리한 농도가 증가함에 따라 histamine의 유리와 COX-2의 활성 억제율은 증가하였다. 또한 꾸지뽕 당단백질의 처리는 HSA에 의해 유도된 세포내 ROS 생성량을 농도에 의존적으로 억제하였다. 한편 꾸지뽕 당단백질을 농도별로 처리하여 세포내 단백질을 추출하여 western blot을 실시한 결과 100 ${\mu}g$/mL 농도의 꾸지뽕 당단백질을 처리한 그룹에서 ERK1/2, AP-1과 COX-2의 활성 수준은 현저히 억제 되었다(p<0.05). 따라서 이러 한 결과에 미루어볼 때, 꾸지뽕 당단백질은 세포내 해독효소의 활성을 증가시킴으로써 ROS 수준을 감소시켰으므로 꾸지뽕 당단백질의 역할이 다른 천연물 유래의 당단백질과 마찬가지로 특이적인 항산화 능력을 지니고 있음을 나타내며 histamine의 유리 억제와 COX-2의 활성이 억제되었을 것으로 생각된다. 이는 꾸지뽕 당단백질이 항 알레르기 효능을 갖는 물질로써 알레르기성 비염, 아토피 등과 같은 알레르기 관련 질환의 예방 및 치료제로 사용될 수 있을 것 사료된다.
본 실험은 콤부차의 발효시 에너지원으로 첨가되는 당(sucrose) 대신 꾸지뽕(Cudrania tricuspidata Bureau; silkworm thorn) 과일 발효액을 첨가하여 꾸지뽕-콤부차의 기능성을 구명하고자 하였다. 대조구인 콤부차는 끓여서 식힌 물 900mL에 홍차 2.4g을 넣어 한시간 동안 추출한 후 초기당도가 10°Bx가 되도록 sucrose를 첨가하였고, 처리구는 sucrose대신 꾸지뽕 과일 무게 대 sucrose의 비율을 1 대 0.9의 비율로 조제하여 발효시킨 꾸지뽕 발효액(당도 50°Bx)을 10°Bx가 되도록 희석하여 첨가하였다. 여기에 발효균인 SCOBY를 첨가한 후 실온에 3주간 보관하면서 1주일 간격으로 시료를 채취하여 총폴리페놀성 화합물 및 카테킨류 함량, 항산화 활성 및 인체 정상 폐세포주인 MRC-5와 폐암세포주인 A549의 세포 증식에 미치는 영향을 구명하였다. 발효 3주 동안 채취한 꾸지뽕-콤부차를 MRC-5 세포에 처리하였을 때 발효 2주까지는 꾸지뽕-콤부차가 대조구에 비해 약 10~30% 세포 증식효과를 보였고 발표 3주째에는 유사한 증식효과를 보였다. 폐암세포주 A549에 처리시에는 발효 2주째 대조구에 비해 낮은 증식율을 보였으나 그 차이는 크지 않았다. 이 결과는 꾸지뽕-콤부차가 인체 폐세포 증식을 촉진하나 폐암세포의 증식을 크게 억제하지는 않음을 의미한다. 총폴리페놀성화합물 함량은 대조구의 경우 발효기간이 경과함에 따라 증가하는 반면 꾸지뽕-콤부차는 조제직후 대조구에 비해 유의적으로 높은 함량을 보이다 서서히 감소하였는데 발효 2주째 대조구와 유사한 수준에 도달하였으며 3주째에는 대조구에 비해 낮은 함량을 보였다. 카테킨류(Epigallocatechin, Epigallocatechin gallate, 그리고 Epicatechin gallate, epicatechin)는 총 페놀성화합물과는 반대의 경향을 보였는데, 발표 2주까지는 꾸지뽕-콤부차의 함량이 유의적으로 높았다가 발표 3주째 크게 낮아졌다. 활성산소 제거능은 발효 2주째까지는 대조구에 비해 낮았으나 3주째 유의적으로 높아져 꾸지뽕-콤부차의 항산화활성은 카테킨류 함량에 비례함을 알 수 있었다. 기능성분 함량과 MRC-5 증식에 관한 상관분석시 총풀리페놀함량이 세포증식에 정의 상관관계를 나타내었다.
본 연구는 꾸지뽕 열매 조다당류 분획물(CTP)의 산화방지 활성 및 신경세포 보호 효과에 관하여 알아보기 위하여, 항산화 활성인 라디칼 제거능 및 환원력을 평가한 결과, 꾸지뽕 열매 조다당류의 농도가 증가할수록 산화방지 활성이 유의적으로 증가하는 것으로 나타났다. 또한, 이러한 꾸지뽕 열매 조다당류의 뇌신경세포 보호 효과에 관하여 알아보기 위하여 생쥐의 해마 유래 뇌신경세포에 꾸지뽕 열매 조다당류를 처리한 후 과산화수소로 산화적인 스트레스를 유도하여 세포 독성에 관하여 알아본 결과, 꾸지뽕 열매 조다당류의 처리는 농도 의존적으로 뇌신경 세포의 생존율을 증가시켰으며, 이에 따라 산화방지 효소인 SOD 활성이 증가하고 지방질 과산화 생성물인 MDA level이 감소한 것을 알 수 있었다. 이상의 결과들로 꾸지뽕 열매 조다당류의 산화방지 활성 및 뇌신경세포 보호 효과에 관하여 확인할 수 있었으며, 추후 어떤 메커니즘으로 신경세포를 보호하는지 추가적인 연구가 필요할 것으로 생각한다. 꾸지뽕 열매 조다당류 분획물은 산화방지 및 산화적 스트레스로부터 신경세포 보호효과를 나타내어 퇴행성 신경질환 예방에 유용한 건강기능성 식품 소재가 될 것으로 사료된다.
동맥경화증은 동맥 내피세포의 손상으로 인해 내막층에 지질이 축적되어 발생 되는 염증성 질환으로 동맥 내막에 침윤되는 백혈구와 백혈구에서 분비되는 전염증성 싸이토카인에 의해 죽종형성이 시작된다. 꾸지뽕은 뽕나무과의 작은 나무로 그 추출물은 항염증, 항산화, 항암의 효과를 가지고 있다. 그러나, 동맥경화증에서 효능은 명확하게 연구되지 않았다. 본 연구에서는 동맥경화증의 초기 진행에서 꾸지뽕의 항염증 효과를 알아보고자 꾸지뽕 뿌리의 추출물을 수득하였고, 동맥경화증의 동물 모델인 ApoE 결손 생쥐에서 복강대식세포를 분리하였다. 분리된 복강대식세포에 LPS로 염증반응을 유발하고 꾸지뽕 뿌리 추출물을 처리하였을 때 100㎍/ml 이하의 농도에서 세포 생존율의 변화가 관찰되지 않아 이 농도를 추가 실험을 위한 유효 농도로 설정하였다. 또한, LPS에 의해 증가한 염증 싸이토카인(MCP-1, IL-1β, IFN-γ, TNF-α, IL-6)의 발현이 꾸지뽕 뿌리 추출물에 의해 감소하였다. 따라서, 꾸지뽕 뿌리 추출물은 동맥경화의 잠재적 위험성을 가지고 있는 대식세포에서 항염증 효과를 나타내어 동맥경화증의 치료제 개발에 이용 가능할 것이다.
꾸지뽕 추출물을 이용하여 건강기능식품 개발을 위한 기초자료로 활용하고자 성장기 정상 설치류에서 2주간 음용 후 혈액 구성 세포, 혈중 지질, 항염 활성 등 생체변화를 측정하였고 천연식물 소재의 위해성 여부 확인을 위해 혈액을 통해 확인 가능한 간, 신장 기능에 대한 생체 지표 변화를 측정하였다. 10주령 SD rat에 꾸지뽕 추출물 30 mg을 매일 2주간 음용시킨 결과 체중 변화, 신장 기능 등의 변화는 없어 비임상독성은 나타나지 않았다. 적혈구와 백혈구 수준은 유의하게 증가하였고 혈소판 수치는 증가 경향을 보여 꾸지뽕 추출물 음용이 혈액 세포의 전반적인 증가를 일으키는 것으로 보인다. 혈중 지질의 경우 꾸지뽕 추출물 음용군이 대조군에 비해 약 27% 중성지질 감소와 함께 약 21% 고밀도지단백-콜레스테롤 증가를 보임으로 혈중 지질 수준 개선 효과를 나타내는 것을 확인하였다. 또한, 간 손상에 대한 생체지표를 확인한 결과 GOT와 GPT 모두 감소하는 경향을 보여 간 기능 개선에 대한 가능성을 확인하였고 혈액 내 사이토카인 변화를 측정하여 꾸지뽕 추출물 음용에 따른 염증성 사이토카인 수준 감소를 확인하였다. 이상의 결과를 종합하여 본 연구 조건에서 꾸지뽕 추출물 음용은 혈구 세포의 생성 촉진과 함께 혈중 지질 개선, 간 기능 개선, 염증 개선 등 다양한 효과를 가지고 있는 것으로 보여지며 향후 관련 기능성 식품 또는 의약품 소재 제품 개발을 통한 활용가치가 클 것으로 기대된다.
염증 (Inflammation)은 물리적인 상처나 세균감염이 되었을 때 손상된 조직을 재생하고 신체를 방어하기 위해 일어나는 선천성 면역반응으로 알려져 있다. 주로 선천면역을 담당하는 대식세포는 lipopolysaccharide, reactive oxygen species와 cytokine 등에 의해 활성화되어 tumor necrosis factor-α. interleukin-1β, interleukin-6 등 염증인자들의 생성에 관여한다. 특히, 산화질소는 superoxide 음이온과 쉽게 반응하고 peroxynitrite와 같은 독성이 강한 산화제를 생성하여 단백질 및 지질의 과산화를 유도하고 세포독성을 일으키는 것으로 보고되고 있다. 따라서 본 연구에서는 항산화 및 항염증 소재를 탐색하기 위해 오미자 (Schisandra chinensis), 꾸지뽕 (Cudrania tricuspidata)을 이용하여 항산화 활성을 평가하고자 하였으며, 세포주를 활용한 세포독성 및 항염증 활성을 확인하고자 하였다. 본 연구는 전북 순창군에서 재배된 오미자, 꾸지뽕을 열 건조(60℃) 통해 건조한 후 분말화하였다. 최적 추출 조건 선정을 위해 다양한 용매 (열수, 증류수, 주정 20, 40, 60%), 온도 (25, 40, 60, 80℃) 및 시간 (1, 2, 3, 4, 5 h) 조건에서 추출된 추출물의 총 폴리페놀 함량을 비교함으로써 최적 조건을 선정하였다. 오미자와 꾸지뽕의 DPPH 및 ABTS radical 소거 활성, 총 플라보노이드 함량을 확인하여 항산화능 및 기능성 성분 함량을 평가하였다. 또한 대식세포주인 Raw 264.7을 활용하여 MTT assay, 산화질소 생성 억제 활성을 확인하여 세포독성 및 항염증 활성을 평가하였다. 실험 결과, 오미자 및 꾸지뽕은 각각 주정 40%, 60℃ 그리고 증류수, 60℃에서 추출 시 가장 높은 총 폴리페놀 함량 (약 98.3 mg GAE/g 및 88.2 mg GAE/g)을 함유하며, DPPH 라디칼 소거 활성은 약 44.6% 및 24.4%, ABTS 라디칼 소거 활성은 약 30.3% 및 40.8%로 확인되었다. 총 플라보노이드 함량은 약 21.80 mg QE/g 및 35.68 mg QE/g으로 확인되었다. 또한 오미자 및 꾸지뽕 기능성 추출물을 100 ug/mL 처리 시 세포 독성이 나타나지 않는 것으로 확인되었으며, NO 생성량을 약 56.3% 및 21.7% 저감시켜 항염증 효능을 나타내는 것으로 확인되었다.
전통발효식품으로부터 분리한 발효능이 우수한 미생물과 기능성이 밝혀진 농특산 향토자원을 활용한 새로운 기능성 장류를 개발하고자 하였다. 꾸지뽕 열매를 A. oryzae koji, Lactobacillus 6종 및 Bacillus 2종에 대하여 발효시킨 결과, B. licheniformis SCDB 1234 균주가 kaempferol 함량을 $9.54{\mu}g/g$에서 $217.04{\mu}g/g$을 약 22배 증강시켜 최종 발효균주로 선발되었다. 꾸지뽕 열매를 선발균주를 활용하여 발효한 발효물 20배 희석액의 DPPH 항산화 활성은 대조구인 BHA, BHT의 92~99 ppm 농도와 유사한 활성을 보였고, tyrosinase 저해 활성도 arbutin이나 kojic acid의 95 ppm과 90 ppm과 같은 높은 저해 활성을 보였다. 꾸지뽕 열매 발효물을 첨가한 된장을 개발하여 유기산, 유리당 및 유리 아미노산을 분석하였다. 전반적으로 꾸지뽕 열매 발효물을 첨가하지 않은 장류와 유의적인 차이점을 보이진 않았다. 꾸지뽕 열매 발효물과 개발한 된장의 pancreatic lipase 저해활성을 측정하였다. 발효물의 경우에는 발효전보다 발효후에 더 높은 80% 이상의 높은 저해능을 보여주었다. 개발한 된장은 숙성전 된장이 숙성후 된장에 비해 더 높은 저해능을 보여주었다. 항당뇨 효과로 AGI활성을 분석한 결과, 꾸지뽕 열매는 발효전보다 발효후에 활성이 높게 측정되었고, 꾸지뽕 열매 발효액 10%를 첨가한 숙성전 된장의 AGI활성은 $84.89{\pm}0.08%$, 숙성후 된장은 $91.25{\pm}0.04%$를 나타내었다. 결론적으로 꾸지뽕 열매의 발효물의 생리활성 및 항산화 활성은 발효를 통하여 상승함을 보여주었고, 새로운 건강기능성 식품 개발에 활용가능성이 높은 잠재적 소재임을 보여준다.
밀양산 꾸지뽕 나무의 부위별(잎, 줄기, 뿌리, 열매) 건조 시료의 분석을 통해 꾸지뽕 나무의 이화학적 성분과 항산화 물질 등의 기능적인 부분에 관한 기초 자료로 활용하고자 본 연구를 수행하였다. 꾸지뽕 나무의 부위별 일반성분의 경우 지방은 1.3~5.9 g/100 g, 단백질은 6.3~18.7 g/100 g, 회분은 2.8~9.0 g/100 g 이었다. 식이섬유 함량은 줄기가 69.2 g/100 g으로 가장 높은 함량을 나타냈고, 그 다음으로 뿌리 부분이(49.9 g/100 g), 잎(45.5g/100 g), 열매(15.6 g/100 g) 순으로 나타났으며, 무기성분(Ca, Fe, Mg, Na, P, Zn)은 전반적으로 잎 부위의 함량이 높은 것으로 측정되었다. 총 폴리페놀 함량은 잎이 571.3 mg%로 다른 부위보다 유의적으로 큰 함량을 보였고, 뿌리 311.7 mg%, 열매 183.4 mg%, 줄기 162.1 mg%로 나타났다. 폴리페놀 함량의 경우에도 잎이 가장 높았으며, 뿌리, 열매, 줄기 순으로 나타났다(p<0.05). 전자공여능 또한 잎의 경우 83.55%로 다른 부위보다 유의적으로 가장 높은 활성을 보였으며, 그 다음으로는 뿌리 부위로 67.76%, 열매 58.27%, 줄기 56.44% 순으로 활성을 나타내었다(p<0.05). 분석 결과 꾸지뽕 나무의 잎, 열매, 줄기, 뿌리 모두에서 항산화 활성이 55% 이상 이었으며, 특히 잎 부위의 무기성분, 폴리페놀과 항산화 물질의 함량이 다른 부위에 비해 높은 것으로 측정되었다. 이러한 꾸지뽕 나무를 부위별로 이용하여 제품화된 차나 건강보조식품 등과 같이 다양한 기능성 식품과 의약품 등으로 활용이 가능 할 것으로 판단된다.
꾸지뽕 열매의 부가가치를 증대하기 위해 꾸지뽕 발효식초를 제조하고 그의 발효조건을 확립하였다. 전통발효식품으로부터 초산내성, 초산 고생산능, ethanol 내성 및 아황산 내성이 우수한 49종의 초산 균주를 분리하였고, 16S rRNA 유전자 염기서열의 해독 결과, Acetobacter indonesiensis, A. cerevisiae, A. orientalis, A. tropicalis, A. fabarum, A. pasteurianus 및 A. syzygii으로 동정되었다. 이들 중 GRAS 균주인 A. pasteurianus SCMA5와 SCMA6를 발효 균주로 최종 선정하였다. 최적 발효는 꾸지뽕 열매 함량이 40%(v/v)인 즙액과 5%(v/v) ethanol을 첨가하여 $25^{\circ}C$에서 72시간 발효가 가장 적절하였다. 관능평가 결과, SCMA06 균주를 적용한 발효액의 선호도가 SCMA05 균주를 적용한 발효액보다 높았다. SCMA06 균주를 사용한 발효식초에서 항산화 능력을 측정하는 DPPH 라디컬 소거활성의 경우 대조구에 비해 $53.02{\pm}0.78%$이상 높게 나타났고, 항당뇨 능력을 측정하는 AGI활성은 발효 72시간에 $91.40{\pm}2.43%$ 저해능을 보여 시판중인 acarbose보다 활성이 높았다. 이번 연구는 꾸지뽕 열매를 활용한 발효식초 제조를 위한 산업화 연구에 기여할 수 있을 것이다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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