인삼 Saponin의 첨가가 효모균체 증식과 균체 지방함량 및 지방산조성에 미치는 영향을 구명하기 위하여 기본배지에 인삼의 crude saponin을 각각 0 % (control) $10^{-4}$ %, $10^{-3}$%, $10^{-2}$ %, $10^{-1}$% 되게 넣고 Rhodotorula glutinis를 접종하여 8 일간 진탕배양한 후 효모의 수율 및 지방산 조성을 비교 조사하였다. 1) 균체수율은 인삼 Saponin로 증가하였으며 $10^{-2}$ % 첨가구 8.45mg/$m\ell$로 가장 높았다. 2) 인삼 Saponin 농도가 증가함에 따라 인삼 Saponin 처리구의 균체지질함량은 $10^{-1}$% 첨가구를 제외한 모든 처리구에서 대조구보다 증가하였으며 그중 $10^{-2}$ % 첨가구에서 49.8%로 가장 많았다. 3) Rhodotorula glutinis의 균체지방산은 Palmitic acid. stearic acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid 등이었으며, 불포화지방산 함양이 포화지방산 함양보다 많았다. 4) 인삼 Saponin 농도에 관계없이 각 처리구의 지방산 함양은 oleic>linoleic>linolenic>palmitic>stearic acid 순으로 많았으며, Saponin 농도 $10^{-2}$ % 이상의 농도에서는 palmitic acid가 linolenic acid 보다 증가하였다. 5) 인삼 Saponin 농도가 증가함에 따라 각 처리구 균체지방산 함량은 증가하였으며, 그중 $10^{-2}$ % 및 $10^{-3}$% 첨가구에서 가장 많았으나 $10^{-1}$ 첨가구에서는 현저하게 감소하였다.
Candida tropicalis KIST 351을 $2.5{\ell}$ 및 $28{\ell}$ 발효조에시 배양하여 석유 유분별자화능, 석유탄화수소기질의 즉차적 유가배양(流加培養), 폐배지(spent medium)의 재사용 및 연속배양 등 배양기술적인 기초문제를 검토한 바 그 개요는 다음과 같다. (1) 각종 경유유분(LGO, HGO, VGO, Diesel oil, SP(E), HGO-wax, L/M-wax)에 있어저 균체농도는 $11{\sim}15g/{\ell}$, 경유에 대한 수율은 $10{\sim}12%$, 소비된 n-paraffin에 대한 수율은 $77{\sim}82%$였다. (2) 동 균주를 유가배양 함으로써 균체들 배지에 대하여 $18.9g/{\ell}$, 경유에 대한 수율을 13%로 향상시킬 수 있었다. (3) 폐배지는 탄화수소를 유화시키고 증식을 촉친하는 효과를 가지고 있었으며 $Mg^{++}$를 보충하지 않었을 때는 20%, 보충하였을 때는 50%까지 회수 재 사용 할 수 있었다. (4) 균체생산을 위한 연속배양의 최적희석율은 $D=0.1{\sim}0.125\;hr^{-1}$의 범위내에 있으며, 이때의 균체농도는 약 $8g/{\ell}$였고, $D=0.125\;hr^{-1}$에서의 균체생산속도는 $1.0\;g/{\ell}/hr$로써 최대치에 달하였다. 소비된 경유 중의 n-paraffin에 대한 균체수율은 $D=0.1\;hr^{-1}$에서 0.94로써 최대치를 보였다. 그러나 희석율 $0.1\;hr^{-1}$에서 공급된 n-paraffin의 약 24%가 기질로써 소비 되지 않었으므로 이에 대한 적절한 대책이 요구된다.
영지버섯의 세포외 다당발효중 동력학적 특성을 기질(포도당, 전분), 기질농도$(1{\sim}7%)$ 및 계대배양(3회)의 함수로서 조사하였다. 영지버섯 균사체 증식은 logistic 모델이 Monod 모델 및 two- thirds power 모델과 비교하여 실험값에 잘 일치하였고, 기질 및 생성물은 Luedeking-Pirt 식에 의하여 잘 설명되었다. 또 다당 생성의 발효 기작은 증식연동형과 비증식 연동형이 함께 존재하는 혼합형이었으나 기질에 상관없이 비증식연동형 기작이 더 중요하였다. Glucose는 농도 증가에 따라 다당생성 및 기질소비의 기작이 증식연동형이 감소하고 비증식연동형이 증가하는 경향을 보였다. 그러나 starch를 사용하였을 경우는 glucose와는 달리, 기질소비의 증식연동형과 비증식연동형 기작이 모두 증가하여 높은 기질 이용성을 보였다. 아울러 starch배지에서는 glucose배지에서 보다 비증식속도의 증가와 계대배양시의 안정성을 보였다. 따라서 영지버섯의 배양시 starch배지는 비증식연동형에 의한 균체 생육 및 다당생성의 생합성 촉진에 의해 이들 생산성 및 계대배양시의 안정성을 증가시키는 것으로 생각되었다 최대의 균사체 생육 및 다당 생산은 각각 9.463 및 10.410 g/l로, 7% starch을 함유한 배지에서 $30^{\circ}C$로 7일간 진탕배양하였을 때 얻어졌다.
Sisomicin 발효에 대한 온도의 영향을 살펴보았다. 각각의 온도에 대하여 균체의 비생육속도로부터 8.2 kcal/g-mol의 activation energy를 얻었다. 이 값은 발효중 균체가 균사체를 이루어 배지성분이나 산소에 대한 Internal diffusion layer를 형성하는 것을 시사해주고 있다. 한편 최종 항생물질농도는 온도가 증가함에 따라 감소하였으며, 온도의 변화를 주는 실험으로부터 대수증식기에 유지되는 배양온도가 최종 항생물질의 농도에 심한 영향을 주는 것으로 나타났다. 배양온도를 변화시켜 항생물질의 생산성을 증가시키는 방법에 대해 생각하여 보았다.
본 연구에서는 형질전환된 P. pastoris를 이용한 재조합 HBsAg 생산에서 유가식 배양시 공급배치 탄소원으로 sorbitol이 단백질 발현에 미치는 영향을 glycerol과 비교하여 실험하였다. 유가식 배양 공급배지 탄소원으로 50% sorbitol을 이용했을 때 50% glycerol을 이용하는 경우보다 세포 증식 측면에서는 methanal 유도 후 균체 농도가 낮은 경향을 보였으나 이것은 glycerol 이 sorbitol 보다 에너지원으로써 높은 affinity를 가지기 때문인 것으로 판단된다. 하지만 단위 건조 균체량당 단백질 발현량은 50% sorbitol을 공급 한 경우 50% glycerol을 공급한 경우 보다 12% 향상되는 결과를 보였다. 따라서 유가식 배양용 공급 탄소원으로 sorbitol을 이용했을 때 glycerol을 이용하는 것보다 AOX promoter에 의한 단백질 발현에 보다 긍적적인 효과가 있는 것을 확인 할 수 있었다.
섬유소 자화세균의 분리 및 이용과정에서 혼합배양하므로써 균체증식이 향상 되었는데, 이러한 혼합배양에 따른 여러 가지 영향과 보조균을 동정한 결과를 요약하면 다음과 같다. 1) Cellulomona flavigena의 단독배양에서는 O.D.가 0.26이였으나, 보조균과 혼합배양하므로써 O.D.가 0.37로 증가하였다. 2) 보조균은 gliding motility가 있었으며, microcyst가 확인되었는데 이것은 Sporocytophga 속과 일치하였다. 3) 혼합배양에서 생육최적 pH는 7.2 부근이 좋았으며, 최적온도는 3$0^{\circ}C$ 부근이었다. 4) 혼합배양에 있어서 두 균의 분포도는 10 : 1 정도로 Cellulomonas flavigena가 주로 분포되어 있었다. 5) Cellulomonas flavigena의 growth factor로서 thiamine과 biotin을 요구하였으며, Sporocytophaga sp.는 vitamin 요구성이 없었다. 6) Cellulomonas flavigena의 단독배양액에서는 추적할 만한 glucose 량이 없었으나, 혼합배양에서는 glucose가 확인되었다. 7) Cellulomonas flavigena의 균체중 필수아미노산으로 valine, leucine, arginime이 비교적 많은 편이였다
높은 유산생성 능력을 가진 lactobacillus bulgaricus NLS-4주를 대창 배양하기 위하여 배양조건을 개선하였다. 이제까지 보고된 많은 배지중에서 7개를 선정하고 흔히 사용되고 있는 11% 탈지유 배지를 대조군으로 하여 사용 균주의 증식과 유산 생성능을 비교한 결과 TIP배지를 최종 선정하였다. 이 배지를 이용하여 38$^{\circ}C$에서 통기없이 200rpm의 속도로 교반해 주면서 IN KOH용액을 사용하여 PH를 6.5로 자동 조절해준 결과 18시간 동안의 회분배양에서 얻은 균체수는 생균수로 $m\ell$ 당 1.0$\times$$10^{9}$ 이었으며 이를 다시 연속 배양한 결과 희석 배율 D=0.17$hr^{-1}$에서 $m\ell$당 총 2.3$\times$$10^{9}$ 의 균체를 얻을 수 있었다.
절간고구마 당화액을 탄소원으로하여 RNA를 다량 축적하는 효모를 선정한 결과 Cryptococcus laurentii가 가장 높은 균체량 및 RNA량을 나타내었다. 이 선정 균주에 대한 배양조건을 검사한 결과 최적 PH 6.0, 3$0^{\circ}C$, 48시간 통기 진탕배양하였을 때 가장 좋은 결과를 얻었다. 이러한 조건 하에서 배지조성을 변화시켜 RNA 함량과 균체증식량을 검토한 결과 (N $H_4$)$_2$S $O_4$ 0.4%, Peptone 0.6%. yeast extract 0.4%가 질소원으로 좋은 결과를 보였으며 K $H_2$P $O_4$의 최적농도는 0.5 %, M $n^{++}$ 은 0.1 %, $Co^{++}$은 0.001 %를 나타내었다. 또 비타민 요구성 실험에서 Ca-pantothenate를 400$\mu\textrm{g}$/$\ell$ 첨가하였을 때 가장 좋은 효과를 얻었으며 기본배지의 배양조건을 검토하여 얻은 최종배지를 비교해 본 결과 효모 균체당 RNA 함량이 12.9%~16.8%로 증가하였다.
Dextransucrase의 수용체반응(acceptor reaction)을 이용하여 판노스(panose)를 포함한 다양한 당전이화합물을 발효식품에서 생성하기 위하여 고활성 dextransucrase를 저온에서 생성하는 Leuconostoc속 균주를 동치미김치로부터 분리 및 선발하였다. 동치미를 제조하여 $8^{\circ}C$에서 발효시키면서 분리한 Leuconostoc속 균주중에서 균체의 증식유도기간(lag phase), 최대균체량(g/L), 균체의 비성장속도$(\mu)$ 및 dextransucrase 활성을 종합적으로 비교하여 우수균주를 선발하였고, 최종적으로 MIDI를 이용하여 Leuc. mesenteroides로 동정하였다. 본 균주는 김치를 포함한 저온성 발효식품에서 당전이화합물을 생성하여 기능성을 부여하는 스타터로 사용될 수 있을 것으로 판단된다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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