느타리버섯 푸른곰팡이병에 대한 품종 저항성은 포장에서 효과적인 검토가 불가능하여 한천 배지상에서 푸른곰팡이균이 균을 저해하는 특징 fungistatic, lysis, toxin enzyme 등에 대한 각각의 특성을 실내에 검정할 수있는 방법을 검토하기 위하여 균사생장과 특이 현상을 조사하였다. 대치배양에서는 느타리버섯 균주에 따라 대치선 형성위치, 푸른곰팡이균의 느타리균사 생장부분 위로 생장(overgrowth), 대치선 이후의 버섯균의 용균(lysis)현상이 발생하여 효과적인 저항성 검정이 가능하였다. 배양여액을 여지에 적용하는 방법은 버섯균과 병원균의 종류에 따른 균사생장 및 특이적 현상이 타나나지 않았으나, well plate를 이용한 배양여액 희석방법으로 균사생장의 억제정도의 확인이 가능하였다. 분활 petri dish를 활용하여 동시배양의 경우 약간의 버섯균이 억제되는 현상은 보였으나, 푸른곰팡이균이 버섯균 생장 부분 위로 덮어 효과검정이 불가능 하였다. 버섯균을 petri dish 전체에 배양한 후 그 위에 병원균의 균총을 접종하는 방법은 overgrowth, lysis등의 현상이 발생하여 병원성의 검정이 용이하였다. 실내에서의 느타리버섯균의 푸른곰팡이병에 대한 저항성 검정은 대치배양, 배양여액법, 생장후 접종법에 의한 방법으로 가능한 것으로 판단되었다.
나노 크기인 5nm 이하로 제조한 은나노제품(파이투패치)은 주요 식물병원균인 탄저병원균(Collectotrichum gloeosporioides), 잿빛곰팡이병원균(Botrytis cinerea), 균핵병원균(Sclerotinia sclerotiorum)에 대해 포자발아 및 균사생장을 억제하는 항균력이 있었다. 파이투패치 살포에 의한 고추탄저병 방제효과를 실험하기 위해 파이투패치 희석액에 포자를 침지하여 포습시킨 후 발아율을 조사한 결과 5ppm까지 희석한 처리구에서 병원균의 포자발아억제효과를 보였으며, 균사는 10ppm에서 생장억제효과가 15일간 지속되었다. 특히 파이투패치를 10ppm으로 희석하여 배지표면에 도말한 후 탄저병원균 포자를 접종하면 3일간 발아가 억제되어 식물체 감염을 효과적으로 예방하였으며, 40% 이상 발병한 시험구에 4ppm 파이투패치를 살포한 결과 21일 후 7% 이하의 발병과율로 무처리 대비 70% 방제효과가 있었다. 장마철 탄저병 발생율이 94.6%인 시험포장에서 10ppm 농도로 파이투패치를 7일간격으로 엽면살포한 결과 발병과 발생율이 5.8%로 방제효과를 확인하였으며, 수확한 홍고추를 자연건조한 후에도 발병과율이 24.2%로 건고추 수확량도 증가하였다. 장마철 고추역병(Phytophthora capsici)은 장마가 끝난 무피복시험구에서 8월 11일 15%이었으며 고온기를 지난 9월 7일에는 발병율이 74%로 수확을 포기하였으나, 파이투패치를 코팅처리한 피복재를 씌운 시험구에서는 발병주가 2.3%로 장마철 역병발생이 효과적으로 방제되었다.
버섯류에 세균병을 유발시키는 Pseudomonas agarici와 P. tolaasii가 팽이버섯균의 균사생장 및 자실체형성에 미치는 영향을 알아보기 위해 접종시기와 접종농도를 달리하여 기내에서 조사하였다. 팽이버섯균과 병원세균을 동시에 접종하거나 팽이버섯균접종 5일후에 병원세균을 접종했을 때 병원세균의 접종농도가 높아짐에 따라 균사생장과 자실체 형성이 현저하게 억제되는 경향이었으며, 특히 $10^2{\sim}10^6\;cfu/g$ media의 접종농도에서 균사생장이 지연되면서 엷음 또는 흐림증상을 보였고 $10^8\;cfu/g$ media농도에서는 특정분위에서부터 균사가 더이상 진전되지 못하는 멈춤증상을 나타냈다. 그리고 P. agarici $10^2\;cfu/g$ media 이상의 농도와 P. tolaasii $10^4\;cfu/g$ media 이상의 농도에서는 자실체의 수확을 전혀 기대할 수 없었다. 두 병원세균 사이의 팽이버섯균에 대한 균사생장억제력은 P. agarici에 비해 P. tolaasii가 다소 높았으며, 자실체형성억제력은 P. tolaasii 비해 P. agarici가 다소 높은 결과를 보였다. 그러나 팽이버섯균접종 10일후 병원세균을 접종한 경우 두 병원세균 모두가 균사생장과 자실체생육에 거의 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
본 실험에서는 microtiter plate를 이용하는 실내 검정법을 이용하여 고추 탄저병균의 기주체 침입 초기에 볼 수 있는 형태 변화인 포자 발아 및 부착과 균사 생장에 미치는 다양한 화합물의 활성을 대량으로 검정할 수 있는 방법을 확립하였고, 기존의 몇 가지 살균제가 가지는 고추 탄저병균의 초기 형태 분화 에 대한 억제 효과를 조사하였다. 본 실내 검정법을 표준화하기 위하여 MTT와 propanol 처리, 접종하는 포자의 농도, 배양 시간들이 병원균의 흡광도에 미치는 영향을 조사하였다. MTT를 12 시간, propanol을 1 시간 처리하였을 때, 그리고 JC24 의 포자를 $1\times10^5$개/mL의 농도로 접종하고 36 시간 배양하였을 때, 병원균의 흡광도가 일관성 있고 높게 나타났다. 살균제의 작용 특성을 알아보기 위해서 6종의 보호용 살균제, 6종의 스테롤 생합성 저해 살균제, 1종의 호흡저해제를 선발하여 microtiter plate 대량 검정 방법에서 효과를 조사하였다. 보호용 살균제 중에서 mancozeb, chlorothalonil, dithianone 등은 $6.25{\mu}g/mL$ 처리구에서도 포자의 발아, 부착과 균사의 생장을 모두 80% 이상 억제하였으나, propineb, iminoctadine, fluazinam 등은 $100{\mu}g/mL$의 처리를 2 시간만에 세척하였을 때 흡광도가 감소하는 것으로 보아 포자 부착 억제 효과는 적었다. 6종의 스테롤 생합성 저해제 중에서 hexaconazole, tebuconazole, myclobutanil 등은 포자의 발아와 균사 생육을 억제하고, 세척할 경우 JC24의 생육 억제 효과가 떨어지는 것을 보아 부착 억제 효과는 기대할 수 없었다. Nuarimol 은 $100{\mu}g/mL$로 처리한 고농도에서만 부착에 대한 억제 효과가 54.7%로 다른 억제 효과보다 우수하였으나, $6.25{\mu}g/mL$의 저농도로 처리하였을 때는 부착 억제 효과가 나타나지 않았다. Kresoxim-methyl은 6.25와 $100{\mu}g/mL$의 농도에서 포자 부착에 대한 억제율이 27.3%와 54.4%로 나타났는데, 처리하는 농도가 높아짐에 따라서 효과도 증가하였다. 이상의 결과와 같이 때 microtiter plate를 사용하여 병원균이 식물체를 침입하는 초기에 나타나는 포자 발아와 부착, 그리고 균사 생장을 검정할 수 있었으며, 본 실험 방법을 통하여 Kresoxim-methyl은 탄저병균의 포자 부착을 특이적으로 억제하는 효과가 있음을 알 수 있었다.
식물병원균 Botrytis cinerea와 Fusarium oxysporum에 대한 생물학적 방제의 기초자료를 얻기 위하여 살충성 진균 Beauveria bassiana의 식물병원균에 대한 균사성장저해, 포자발아 억제, 균사와 포자의 형태변화 등의 효과를 살펴보았다. 평판배지 상에서 두 식물병원균의 균사생장이 저해되었으며, 저해효과는 배지종류에 따라 달랐는데 B. cinerea의 경우 PDA배지에서 가장 크게 저해되었으며 F. oxysporum의 경우에는 TSA배지에서 가장 크게 저해되었다. B. bassiana는 $25^{\circ}C$에서 6일간 배양했을 때 F. oxysporum에 대한 항균력이 가장 높았으며 동시에 최대의 균체량을 생산하였다. 또한 B. bassiana의 배양여액을 식물병원균에 30% 농도로 첨가하여 배양했을 때 식물병원균의 포자 발아율은 B. cinerea, F. oxysporum에서 각각 30%(control: 88.2%), 10.0%(control: 78.6%)로 낮아졌으며 발아 개시 시간도 4~8시간 지연되었다. 현미경을 통한 미세구조관찰에서는 10%의 B. bassiana배양여액을 첨가했을 때 F. oxysporum의 포자 크기가 1/2~1/3으로 줄어들었으며 균사와 격막의 형태도 비정상적으로 변하여 균사외막과 격막-격막 사이의 구분이 불명확해졌다.
A. nidulans의 색소결핍 억제돌연변이주(Suppressor mutant of the null pigmentation; SU-NPG)의 세포벽 구조가 색소형성 및 균사분지에 미치는 영향을 조사하여 다음의 결과를 얻었다. SEM으로 세포 표면구조를 관찰한 결과, 완전배지에서 배양된 SU-NPG의 분생포자벽은 최외각 층이 6일 째부터 박리되었으며, 균사생장이 저조하였다 TEM으로 관찰한 결과, 균사 세포벽은 매우 두꺼워졌다. 이러한 전자현미경관찰 결과는 이들 돌연변이주의 세포벽 구조가 NPG 및 야생형의 그것과는 다르다는 것을 시사한다. 균사에 탄수화물 염색을 한 후, 세포화학적 미세구조를 관찰한 결과, 분생포자벽은 C1, C2, C3와 C4 층으로 되어 있었고, 균사 세포벽은 H1, H2, H3와 H4층으로 되어 있었다. 이러한 C3층과 H3층은 세포분화 시 색소형성 및 균사 분지형성에 필수적인 세포벽 구조임 을 시사한다. SU-NPG는 FGSC4에서와는 다르게 비정상적인 균사생장을 하였지만, 색소결핍 돌연변이를 억제하는데, 이는 SU-NPG의 균사 세포벽에는 H3층이 형성되었으며, 세포벽 형성과정은 정상적으로 진행되기 때문으로 사료된다.
양식 가물치로부터 Saprolegnia sp.를 분리하고 그들의 일부 생리학적 특성과 제어를 위한 식물 추출물(精油)을 탐색하였다. 분리된 Saprolegnia sp. 영양체 생장 최적 온도는 $25^{\circ}C$이었고, 최적 pH는 6.0이었으며, 최적 NaCl 농도는 0%이었다. 또한 phosphate 10 mM 농도와 casamino acid 10mg/L농도에서 균사의 생장은 잘되었다. Saprolegnia sp.의 제어 정도를 조사하기 위해 쑥, 편백, 측백나무로부터 정유를 분리하여 10, 100, 500, 1,000, 1,500, 2,000ppm에서 처리한 결과 쑥 정유는 처리농도 10 ppm 이상 농도에서부터 억제 양상이 나타나다가 농도가 높아질수록 더 많은 억제양상을 나타냈다. 측백과 편백나무 정유를 처리한 것에서는 10ppm이상 처리 농도에서부터 억제되기 시작하여 그 이상의 처리 농도에서는 상당한 균사 생장 제어 효과를 나타내다가 500 ppm 이상 처리 농도에서는 완전한 제어 효과를 나타냈다. 또한 Saprolegnia sp.에 감염된 가물치의 조직 병리학적인 조사를 실시한 결과 균사가 감염된 근육조직 부분에는 깊은 곳까지 균사가 침투하였고, 아가미의 세포는 곤봉형태를 나타냈으며, 간조직 세포에서는 일부가 괴사되었고 부분적으로 ceroid 물질이 침착되어 있었다. 또한 비장조직 세포에서는 일부 괴사된 세포를 관찰하였고, ceroid 물질의 침착을 볼 수 있었다. 신장조직은 세뇨관의 상피세포에서 일부 괴사를 관찰하였고, 조혈 조직에는 ceroid 물질의 침착상태가 나타났다.
2012년부터 2013년에 걸쳐 식물체 근권과 비근권 토양을 수집하였다. 수집한 토양을 희석평판법을 이용하여 총 782개의 세균을 분리하였고, 분리한 세균을 실험실내에서 Trichothecium roseum과의 대치배양을 통해 균사생장억제율이 80% 내외로 우수한 길항력을 나타내는 균주를 선발하였다. I-plate에서 HK2균주와 T. roseum두 균을 격리하여 밀폐배양 시 모두 균사생장억제 효과는 없기 때문에 휘발 물질은 아닌 것으로 판단되었다. NB배지에 길항균주와 T. roseum을 액체배양 한 결과 88% 이상 균사생장억제 효과를 보였다. HK2균주를 동정하기 위해 16S rDNA 염기서열분석과 API 50 CHB Kit (BioMerieux, France)를 이용하여 생화학적 특성을 분석한 결과 Bacillus subtilis로 동정되었다. HK2 균주가 생산한 항진균물질을 butanol로 추출한 후 flash column chromatography를 이용하여 항진균물질을 정제한 결과 methanol 80%의 조건에서 잘 분리되었으며 향후 분리 순화를 통한 화학구조분석이 필요하다.
Chitin합성 저해제인 buprofezin이 Coriolous versicolor, Ganoderma lucidum, 및 G. applanatum 균사의 생장과 원형질체 나출 및 재생에 미치는 영향을 조사한 결과 buprofezin은 C. versicolor, G. lucidum 및 G. applanatum의 균사생장을 심히 저해하였고 첨가농도가 높을수록 균사생장 억제가 심하였다. Buprofezin처리에 의하여 기균사 및 oidia 형성량은 증가하였으나 균사의 형태에는 변화가 없었다. G. applanatum은 buprofezin 처리에 의하여 원형질체 나출량과 재생율이 현저히 증가하였으나, G. lucidum은 원형질체의 나출량과 재생율이 감소하는 경향을 보였으며 C. versicolor의 경우에는 원형질체 나출량이 증가하였으나, 재생율은 무처리와 차이를 보이지 않았다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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