본 연구에서는 토양에 오염된 디이젤 성분을 제거하기 위한 토양세척 기술 중에서 적절한 계면활성제를 사용하여 토양입자에 결합되어 있는 유해 유기물질의 표면장력을 약화시켜 제거하는 기술을 이용하기 위해 생분해성이 우수하고 2차 오염문제가 없는 생물계면활성제를 생산하였다. Peudomonas aeruginosa ATCC 9027를 이용하여 생산된 생물계면활성제인 rhamnolipid와 기존에 사용되고 있는 화학계면활성제와의 디이젤 세척효능을 비교분석하였다. 회분식, 연속식 세척실험 결과 디이젤 오염토양 초기농도 5,000ppm에서 계면활성제 1%, 세척시간 24시간 경과 후 본 연구에서 생산된 rhamnolipid의 세척효율이 모두 약 95%로 사용된 계면활성제 중에서 가장 우수한 세척효율을 보였다. 화학계면활성제들은 대부분 50∼80% 미만의 세척효율을 나타내었으며, HLB값이 8에서 15사이에서의 화학계면활성제의 경우 75%이상의 분해효율을 나타내었다. 그러나, HLB값이 8이하이거나 15이상에서는 60%이하의 낮은 디이젤 분해효율을 나타내었다.
유류오염토양의 자연복원 시 생물이용도(bioavailability)를 높이기 위해 사용되는 계면활성제의 영향을 살펴보고자 제지 폐수로부터 분리한 미생물과 5가지 계면활성제를 사용하였다. 계면활성제로는 Brij 35, Brij 30, Triton X-100, Tween 40, Tween 80을 사용하였으며 유류오염물질로는 PAHs를 사용하여 계면활성제 별 미생물의 성장률 및 PAHs 분해율을 살펴보았다. 그 결과 각각의 계면활성제에 따라 서로 다른 미생물 성장 및 PAHs 분해능을 보였다. 계면활성제에 따른 미생물 성장은 Tween 계열에서 뚜렷했으며 이들 중 Tween 40에서는 PAHs의 분해능 또한 가장 활발하였다.
오염된 토양 중 phenanthrene의 분해에 미치는 비이온계 계면활성제와 생물계면활성제의 영향을 살펴보았다. 비이온계 합성 계면활성제로 polyoxyethylene oreyl esterC$^{17}$ H$^{33}$ COO($C_2$$H_4$O)nH) 와 생물계면활성제인 sophorolipid를 적용하였다. 계면활성제의 농도, 수분함량, 접종균 처리 방법 및 종류, pH, 온도, 부가영양분 등의 변수들이 phenanthrene의 생분해에 미치는 영향을 비교실험 하였다. 계면활성제 농도가 CMC이하의 경우 계면활성제는 phenanthrene의 생분해성을 촉진하였으나, CMC 값 이상의 영역에서는 계면활성제가 미생물의 phenanthrene분해작용을 저해하였다. 30%의 수분함량과 pH 7, $30^{\circ}C$에서, 부가영양분으로 glucose를 10g/L수준으로 첨가하였을 때 좋은 분해도를 나타내었다. 충진제로 짚이 첨가되는 경우 토양 : 짚의 중량비가 5:2이고, 수분함량이 50%인 경우 phenanthrene의 분해가 촉진되었다.
생물계면활성제 생성균주, Pseudomonas aeruginosa F722를 이용하여 다양한 배양조건과 배지조성에서 생물계면활성제 생산성을 검토하였다. 질소원과 탄소원을 검토하기 전에는 P. aeruginosa F722의 생물계면활성제 생산량은 0.78 g/l이었다. 하지만, 질소원과 탄소원을 검토한 후에는 생물계면활성제 생산량이 2배 증가한 1.66g/l이었다. 무기질소원으로 $_NH4$Cl 또는 $NaNO_2$를 첨가하였을 때 생물계면활성제 활성에 효과적이었으며 유기질소원으로는 yeast extract 또는 tryptone을 첨가하였을 때 생물계면활성제 활성이 높았다. 이중 무기 질소원으로 0.05% $NH_4$Cl , 유기 질소원으로 0.1% yeast extract를 질소원으로 첨가하였을 때 가장 최적이었다. 탄소원으로 소수성 기질(n-alkane) 또는 친수성 기질(glucose, glycol)을 첨가하여 생물계면활성제 생산량을 조사하였는데 소수성 기질보다는 친수성 기질인 3.0% glucose를 첨가하였을 때 생물계면활성제 생산량이 높았다. 이때의 탄소원/질소원 비율은 17~20이었다. P. aeruginosa F722는 배양조건 3.0% glucose, 0.05% $NH_4$Cl, 0.1% yeast extract, $35^{\circ}C$, pH 7.0, C/N ratio 20, 5 days에서 생물계면활성제 생산량은 1.66g/l이였다. 질소원이 결핍 후 탄소원을 첨가하여 배양하였을 때가 질소원과 탄소원을 함께 첨가하여 배양했을 때보다 생물계면활성제 생산속도 및 균체 생장속도가 높았다. 최적 배양조건하에서 얻어진 배양액의 표면장력은 30mN/m이었다.
본 연구에서는 불소계 계면활성제 FS-606 첨가가 탄화수소계 계면활성제 CDP-W에 의한 n-헥산 가용화에 미치는 영향에 관한 실험을 수행하였다. 오일 방울 접촉 실험방법을 사용하여 측정한 가용화 속도는 초기 n-헥산 오일 방울 크기에 상관없이 일정하게 나타났으며, 계면활성제 농도에 따라 거의 선형적으로 증가함을 알 수 있었다. 이러한 결과로부터 FS-606과 CDP-W의 혼합 계면활성제에 의한 n-헥산 오일의 가용화는 계면 조절 메커니즘을 따르는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 FS-606과 CDP-W의 혼합 계면활성제 시스템에서의 FS-606 조성 증가에 따라 가용화 속도는 증가하여 최대를 나타낸 후 다시 감소하였다. 반면에 FS-606 조성 증가에 따라 계면활성제 수용액과 n-헥산 오일 사이의 계면장력은 감소하여 최소를 나타낸 후 다시 증가하였다.
본 연구에서는 생물계면활성제와 비이온계 계면활성제 용액의 pH 변화가 phenanthrene의 용해도 증가에 미치는 영향을 수용액 시스템에서 조사하고자 하였으며, PAHs-분해균주가 phenanthrene을 분해할 경우 이러한 용해도의 변화가 분해균주의 활성과 전체 분해율에 주는 영향을 파악하고자 하였다. 생물계면활성제 rhamnolipid와 비이온계 합성계면활성제 tween 80의 phenanthrene에 대한 solubilization capacity를 조사하기 위한 회분식 실험의 결과 MSR (Molar Solubilization Ratio)은 각각 0.0425와 0.1449로 나타났으며, 생물계면활성제 첨가로 인한 phenanthrene olubilization 기작이 평형에 도달하기 위한 시간은 24시간 정도로 나타났다. 임계마이셀 농도의 약 4.3배에 해당하는 240ppm의 생물계면활성제를 첨가하였을 경우, 증류수만을 첨가하였을 경우 용해도보다 약 9배 이상 phenanthrene의 용해도가 증가하였다. 또한, 생물계면활성제의 pH 변화가 phenanthrene solubility에 주는 영향을 살펴본 결과, 가장 높은 용해도를 나타낸 pH는 240ppm과 2000ppm의 생물계면활성제를 첨가한 경우 모두 pH 범위 4.5-5.5로 나타났다. 이는 rhamnolipid의 친수성 부분의 음전하 세기가 pH에 따라 달라지는 현상에 기인한 것으로 보여진다. 생물계면 활성제가 존재하지 않는 조건에서, pH의 변화가 phenanthrene 분해균주인 CRE7의 생장률과 분해능에 주는 영향을 조사한 결과, 최대 비성장률은 pH 6에서 나타났지만, pH 5-7 범위에서 크게 변화하지 않았다. 이러한 비성장률의 차이가 분해능에 미치는 영향을 확인한 결과, 높은 비성장률은 결과적으로 높은 분해율을 나타내는 것으로 보여졌다. 생물계면활성제를 첨가한 경우, 생물계면활성제를 첨가하지 않은 실험결과에 비교해 볼 때, pH 4를 제외하고 전체적으로 비성장률이 증가한 경향을 보였으며, 전체 분해율도 증가하는 추세를 나타내었다. 생물계면활성제의 첨가로 인해 pH 5에서의 비성장률은 첨가하지 않았을 경우에 비해 약 1.5배 증가하였으며, 이는 생물계면활성제가 phenanthrene의 용해도를 pH 5에서 약 5배이상 증가시킨 것과 비교하여 볼 때, 그 증가폭이 적다고 할 수 있다. 이러한 결과는 생물계면활성제의 첨가로 인해 마이셀 구조안으로 용해되어진 phenanthrene 의 경우 분해균주의 접근이 용이하지 않아 분해되기 어렵다는 것을 말해주며, pH에 따라 나타나는 서로 다른 구조의 phenanthrene-rhamnolipid의 집합체는 생물학적 이용도 또한 달라질 수 있음을 의미한다.
본 연구에서는 원유, 휘발유, 등유, 경유를 분해하면서 생물 계면활성제를 생산하는 균주인 B. subtilis JK-1을 선별하여 생물계면활성제 생산에 관한 연구를 수행하였다. 생물계면활성제 생산을 위한 최적 배지를 결정하기 위해 다양한 탄소원과 질소원, 무기염류를 조사하였다. B. subtilis JK-1은 탄소원인 1.0%(w/v) soluble starch와 질소원인 0.5% (w/v) skim milk를 포함한 배지에서 96 시간 동안 배양한 결과 가장 많은 생물계면활성제를 생산하였으며, 이 때 탄소원과 질소원의 비율은 2.0이었다. 그리고 0.1% (w/v)의 $KNO_3$는 생물계면활성제 생산을 위한 최적 무기염으로 확인되었다. B. subtilis JK-1은 LB 배지와 TSB 배지보다 본 연구에서 확립한 생물계면활성제 생산 최적 배지에서 더 많은 생물계면활성제를 생산하였다. 생물계면활성제 생산 최적 배지에서 B. subtilis JK-1 배양액의 표면장력은 균주 접종 후 48시간 만에 47.3 dyne/cm에서 24.0 dyne/cm로 감소하였다.
토양 슬러리 시스템에서 유해물질의 미생물 분해시 계면활성제를 고려한 속도론적 모델을 개발하였다. 이 모델은 오염물질과 계면활성제의 분배, 미생물의 수용액상, 미셀상, 흡착상 분해, 계면활성제 첨가에 의한 대상물질 용해, 대상물질의 물질전달을 포함한다. 오염물질은 phenanthrene, 계면활성제는 Triton X-100, Triton NP-10, Igepal CA-720, Brij 30을 적용하였다. 미셀상 분해가 존재할 경우 매우 낮은 미셀상 이용도에서도 전체 분해속도를 크게 향상시킬 수 있었다. 미셀상 이용성이 존재하는 경우와 그렇지 않은 경우 모두 계면활성제 농도가 증가할수록 수용액상 농도가 감소하여 전체 분해속도는 감소하였다. 흡착상 분해는 수용액상 분해나 미셀상 분해와 비교하여 전체 분해속도에 미치는 영향이 적었다. 본 모델은 계면활성제를 이용한 오염토양 생물복원시 계면활성제 탐색과 최적 공정 설계에 활용될 수 있을 것이다.
대전일원의 유류오염 지역의 토양에서 분리된, 생물 계면활성제 생성능이 우수한 Pseudomonas sp. G314균주 [23]가 생산하는 생물 계면활성제의 특성을 조사하고 그 성분을 확인하였다. Pseudomonas sp. G314가 생산하는 생물 계면활성제는 상온에서 10일 보관 후에도 26.2 dyne/cm 정도의 표면장력을 유지해 냉장 보관한 계면활성제와 비슷하게 안정하였고, 5 l 발효조를 이용한 배양에서 회분배양의 25 dyne/cm 보다는 약간 높은 27 dyne/cm 정도의 계면활성제를 생산해 대량 배양 할 수 있음을 확인하였다. 또 이 계면활성제는 acetone과 methanol에 잘용해 되고 benzene과 toluene에 약하게 용해되어 glycolipid 계열의 생물계면활성제임이 추정되었고[23], 이를 silica gel column을 통해 용출하고, TLC로 전개하여 확인된 Rf 0.58인 spot이 bial's reagent와 rhodamine 6G에서 양성반응을 나타내 Pseudomonas sp. G314가 생산하는 생물 계면활성제는 탄수화물과 지질이 함유된 glycolipid 계열의 생물 계면활성제임을 확인하였다.
본 연구의 목적은 원유에 오염된 지역의 토양시료로부터 분리한 생물계면활성제 생산균주의 특성을 조사하기 위하여 실시하였다. 1% 원유를 포함하는 배지에서 균주 HK-3의 배양기간 동안, 생장, 생물계면활성제의 생산, pH의 변화 등을 조사하였다. 생물계면활성제의 생산능력이 뛰어난 균주인 HK-3를 선별하여, 이 균주의 배양기간에 따른 생장 변화와 생물계면활성제의 생산량, 그리고 pH에 대하여 관찰하였다. HK-3는 배양 36시간이 경과하였을 때, 가장 많은 양의 생물계면활성제를 생산하였다. 생물계면활성제 생산에 대한 부가탄소원의 효과를 알아보기 위하여 HK-3를 다른 부가탄소원(예, glucose, dextrose, mannitol, citrate, acetate)과 함께 배지에서 배양하였다. 그 결과, 생물계면활성제의 최대생산량은 mannitol을 포함하는 BH 고체평판배지에서 관찰되었으며, 투명대의 면적은 직경은 약 7.64 cm2로 측정되었다. 분리균주의 생리학적 및 생화학적 특성을 조사하였으며, 주사전자현미경을 통하여 불규칙한 막대형의 세균으로 관찰되었다. BIOLOG 시스템과 16S rRNA 염기서열을 이용한 계통유전학적 분석을 통하여 동정하여 Pseudoalteromons 종으로 확인되어 Pseudoalteromons sp. HK-3로 명명하였으며, GenBank에 [FJ477041]로 등록하였다.
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[게시일 2004년 10월 1일]
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