Identification of Genetic Markers Distinguishing Golden Flounders from Normal Olive Flounders Paralichthys olivaceus Using Microsatellite Markers

황금색 넙치(Paralichthys olivaceus)의 발현을 예측할 수 있는 Microsatellite Marker 개발

Abstract

Despite its economic importance, olive flounder Paralichthys olivaceus aquaculture industry is facing a crisis with a continuous production decline. There have been many solutions to overcome the complicate predicament proposed. Increasing genetic diversity and discovering new commercial value through selective breeding are among them. The aims of the present study are to increase the selection power of the golden flounders. We examined the genetic diversity of the breeder population of golden flounders and developed selective markers for the golden flounder population. The 6 microsatellite (MS) markers were selected from melanogenesis-related genes, which are believed to be involved in the pigmentation of fish. All markers were polymorphic (except PO4) and 5 of them had PIC value of 0.6 or above. All makers had distinctive alleles indicating either normal or golden individuals. For examples, from PO4 marker, the frequency of an allele (316) in the golden population was 100% and in normal population was 0% (P<0.001). Although some more studies with more samples at the later generations should be performed to confirm this result, the 316 allele from PO4 marker could be a distinctive tool for decision of the colors in olive flounders at an early stage of the life cycle.

서론

넙치(Paralichthys olivaceus)는 우리나라, 일본 및 중국 연안에 널리 분포하고 있는 어종으로, 상품성이 높은 대표적인 양식어종이다(Lee, 2006; Hwang and Myeong, 2010). 2018년 국내 넙치의 양식생산량은 약 32,238톤으로 전체 어류양식생산량의약 46%를 차지하고 있다. 하지만 41,636톤을 생산한 2016년과 41,207톤을 생산한 2017년을 비교해볼 때 생산량이 지속적으로 감소하고 있다(KOSIS, 2019). 양식 종자의 열성화, 양식 생산 단가 상승, 수요와 공급의 불균형 등으로 인해 현재 넙치 양식산업은 큰 위기를 맞이하고 있다. 특히 선어로 이용되는 대체어종인 연어(Oncorhynchus keta)와 방어(Seriola quinqueradiata)의 소비량이 크게 늘면서 넙치양식 어가 수가 급격하게 줄었다(KOSIS, 2019). 따라서 이러한 어려운 상황을 극복하기 위해 선발육종을 통한 고부가가치 넙치의 종자개발이 새로운 대안으로 제기되고 있다.

어류의 체색은 시장에서 상품가치를 결정하는 중요한 경제적 요인으로 인식되고 있으며, 멜라닌(melanin), 카로티노이드(carotenoid), 프테리딘류(pteridine), 퓨린류(purine)는 체색을 조절하는 주요 결정 요인으로 알려져 있다(Kennedy, 1979). 색소세포는 전구세포인 chromatoblast의 분화과정에 따라 흑색 멜라닌을 생성하는 melanophore, 황금색 색소를 가지는 xanthophore, 그리고 반짝이는 은빛 색소를 가지는 iridophore로 발달하게 되는데, 마우스 또는 토끼와 같은 포유류의 단순한 백화현상(albino)과는 달리 어류에서는 melanophore로 분화가 억제되면 xanthophore로의 분화가 촉진되어 황금색이 나타난다고 알려져 있다(Lin and Fisher, 2007; Nord et al., 2016). 체색발현과 고정에 관한 연구는 zebrafish에서 주로 이루어지고 있는데, tyrosinase의 발현조절을 통해 chromatoblast의 melanophore 분화가 억제된다고 보고되었다(Lamason, et al., 2005; Minchin and Hughes, 2008; Curran et al., 2010). 넙치의 경우 색소포 부족으로 색상이 발현되지 않는 유안측 백색증(hypomeanosis)과 과도한 색소포 발현으로 흑색 반문이 발생하는 무안측 흑화증(hypermeanosis)이 대표적인 멜라닌 이상 증상으로 넙치의 상품성을 결정하는 체색 변화이다(Shikano, 2005; Kang et al., 2007; Kang at al., 2016).

멜라닌 색소 결핍으로 인한 체표 전체의 체색변화는 두가지로 형태로 알려져 있다(Veena et al., 2011; Muto et al., 2013; Song et al., 2017). 특정 유전자 변이에 의해 망막 및 체표의 멜라닌 소체(melanosome) 발현이 억제되어 발생하는 알비노(albino),망막의 멜라닌소체는 발현이 되지만 표피의 색소침착은 억제되는 루시즘(leucism)이 있다(Kinnear et al., 1985). 루시즘은 유전적 요인, 내교배(inbreeding), 환경요인으로 인한 생리적 변화 등이 원인으로 알려져 있으며, 알비노와는 달리 비가역적으로 체색 변화가 유도되기 때문에 발생기전에 대해서는 명확히 밝혀져 있지 않다(Kuriiwa et al., 2007; Veena et al., 2014; Song et al., 2017). 하지만 어류의 루시즘 개체에 대한 연구는 지속적으로 보고되고 있으며, 상업적 가치를 위한 선택적 육종을 통해서 루시즘 품종을 개발한 것으로 알려져 있다(Kadlec, 1995; Odenthal et al., 1996; Quigley et al., 2017; Quigley et al., 2018; Quigley and MacGabhann, 2018). 본 연구에 이용된 황금넙치는 망막의 색소침착이 이루어져 있으나 체색이 황금 빛을 띄는 특이 개체로, 성체가 되는 과정에서 체색 변화가 이루어지는 것으로 보아 루시즘 개체로 추정된다. 하지만, 발달과정 중에 체색 변화가 없는 개체 부분적으로 체색 변화가 발생하는 개체 등 동일한 집단임에도 불구하고 체색 발현이 일괄적으로 이루어 지지 않아 이를 극복하기위한 체색 발현연구가 필요한 실정이다.

따라서, 본 연구는 일반넙치와 황금넙치의 유전형을 비교하여 황금넙치의 체색 마커를 개발하고자 하였다. 넙치의 멜라닌 합성 신호전달 기전과 관련된 유전자의 microsatellite (MS) 마커개발을 통해 황금넙치 특이적인 대립유전자를 찾고, 이를 토대로 황금넙치 조기 판별을 위한 유전자마커 개발 및 새로운 종자개발을 위한 기초자료를 제공하고자 한다.

재료 및 방법

시료 수집 및 DNA 추출

넙치 시료는 영어조합법인 해연(Jeju, Korea)에서 사육중인 일반 넙치 90개체와 체표의 색이 황금색인 황금넙치 109개체를 선별하여 총 199개체를 이용하였다. 각 개체의 꼬리지느러미 조직 10 mg을 잘라 100% 에탄올에 넣은 후 -20°C 보관하여 사용하였고, DNeasy blood and tissue kit (Qiagen, Germantown, MD, USA)으로 제조사에서 제공하는 표준 방법을 변형하여 total genomic DNA를 추출하였다.

Microsatellite marker 개발

MS (microsatellite) 마커는 여섯 마리의 일반넙치에서 추출한 genomic DNA (deoxyribonucleic acid)를 이용하여 pairedend library를 만들었으며, Hiseq4000 (Illumina, San Diego,CA, USA) 플랫폼으로 염기서열을 생산하였다. 생산된 raw sequence는 Quality score 20을 기준으로 trimming 하였고, SOAPdenovo2 (v2.04) software (Luo et al., 2012)를 기반으로 De novo assembly를 수행하였다. MS 서열은 MIcroSAtelitte(MISA) tool을 사용하여 탐색하였다.

개발된 MS 마커는 황금넙치와 일반넙치의 RNA sequencing을 이용한 differential expressed gene analysis 결과를 바탕으로 발현량의 차이가 있는 유전자를 1차적으로 선별하였으며, 이후 멜라닌 합성과 관련된 MS 서열을 2차 선별하여 본 연구에 사용하였다(data not shown). 선별된 MS 영역을 증폭하기 위한 primer는 Primer3 software를 활용하였고, TM 값을 58-62°C, 증폭 산물의 크기는 150-350 bp로 설정하여 MS 마커를 디자인하였다. 또한 reverse primer의 5’말단에 oligomer (GTTTCT)를 추가하여 background noise를 줄이는 방법으로 제작하였다(Table 1).

Table 1. Information on 6 microsatellite markers used in this study

Multiplex-PCR

Multiplex-PCR (polymerase chain reaction) 반응액은 Genomic DNA 100 ng, primer mixture 8 μL, hot start Taq DNA polymerase 0.6 μL, 10x buffer 1.8 μL, dNTP 1.5 μL를 첨가한 후, 반응액을 총 15 μL로 제조하였고, geneAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 이용하여 PCR을 진행하였다. PCR 분석은 95°C에서 10분간 predenaturation을 실시한 후 95°C에서 60초, 58°C에서 60초, 72°C에서 60초를 1 cycle로 하여 35 cycle 반복하였고, 마지막으로 70°C에서 10분 extension 후 4°C에서 종료하였다.

Microsatellite 유전자형 분석

증폭된 PCR 산물은 30배로 희석시킨 후, 증폭산물 1 μL와 GeneScan 500 LIZ dye Size Standard (ThermoFisher Scientific, Walthamm, MA, USA) 및 Hi-Di Formaide (Applied Bio-systems, Foster City, CA, USA) 혼합물을 1:9로 희석하여 분석을 위한 시료로 사용하였다. 이 후 자동염기서열 분석장치 인 3730xl DNA Analyzer (ThermoFisher Scientific, Walthamm, MA, USA)를 이용하여 모세관 전기영동을 실시하였다. 각 마커에 대한 표준 대립유전자를 분석하기 위해 geneMapper version 4.0 (ThermoFisher Scientific, Walthamm, MA, USA) 분석 프로그램을 이용하여 모든 개체를 분석하고, 크기와 표식자의 종류별로 분류하여 분석하였다.

유전다양성 및 통계 분석

6개의 마커를 이용하여 일반넙치 집단과 황금넙치 집단의 유전적 다양성 분석을 수행하였다. 각 유전자좌의 대립유전자의 수(number of alleles, K), 기대이형접합율(expected hetero-zygosity, Hexp), 관측이형접합율(observed heterozygosity, Hobs), 다형성정보지수(polymorphism information content, PIC), Hardy-Weinberg equilibrium (HWE)에 대한 유의성 검증은 adjusted P 값인 Bonferroni correction을 적용하여 Cervus 3.07 software를 이용하여 분석하였다(Marshall et al., 1998). 또한 대립유전자 풍부도(allelic richness, Ar), 근교계수(inbreeding coefficients, Fis), 유전자 다양성 지수(gene diversity)는 FSTAT 2.9.3 program으로 분석하였다. 통계 분석은 로지스틱 회귀분석(logistic regression)으로 P value가 0.05 미만인 대립유전자를 선별한 후 교차비(odds ratio)와 신뢰도(95% confidence interval)를 구하였고, 카이제곱 검증(Chi-square test) 및 Z-검정(Z-test)를 통해 유의성 분석을 실시하였다. 모든 통계 분석은 R ver. 3.5.0 (The R Foundation, Vienna, Austria; http://www.R-project.org)를 사용하였으며, P value<0.05일 때 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.

결과 및 고찰

일반넙치 집단과 황금넙치 집단의 유전다양성 및 특성 분석

멜라닌 합성과 관련된 유전자에서 선별한 6개의 MS 마커를 활용하여 일반넙치 집단(n=90)과 황금넙치 집단(n=109) 총 199마리의 넙치를 대상으로 유전다양성을 분석하였다(Table 2, 3). 일반넙치 집단의 평균 대립유전자의 수는 평균 5.3개, 평균 대립유전자 풍부도는 8.2개로 황금넙치 집단보다 2.84개 높게 관찰되었다. 일반넙치 집단의 평균관측이형접합율은 0.61, 평균기대이형접합율은 0.68의 수치를 보여 관측이형접합율이 기대이형접합율 보다 낮은 값을 보였다. 반면에, 황금넙치 집단에서는 관측이형접합율이 기대이형접합율과 비교하여 높은 값을 나타냈다. 황금넙치 집단은 친자확인을 위한 넙치 MS 마커를 활용하여 유전다양성을 확보할 수 있는 교배지침을 적용하여 세대 생산을 수행하기 때문으로 판단된다. 다형성정보지수는 일반넙치 집단과 황금넙치 집단에서 각각 평균 0.65 및 0.60으로 0.5 이상의 값을 보여 0.01과 0.38의 값을 나타낸 PO4마커를 제외한다면 적절한 다형성 정보를 반영하기에 황금넙치 판별을 위한 마커로 이용할 수 있을 것으로 판단된다. 근교계수는 일반넙치 집단에서 평균 0.09, 황금넙치 집단에서 평균-0.21로 음의 값을 보였다. 근교계수는 개체 내에 포함된 아집단(subpopulation)에서의 변이의 비율을 의미하는데, 두 집단 모두 매우 낮은 근교계수 값으로 확인되었다. 또한, 유전다양성 지수의 값이 일반 및 황금넙치 집단에서 각각 0.68 (0.01-0.91)과 0.60 (0.51-0.77)의 값으로 나타났다. 일반넙치 집단의 PO4마커가 0.01로 가장 작고, PO6 마커가 0.91로 가장 높게 나왔으며, PO4 마커를 제외한 모든 마커에서 유전다양성이 비교적 높게 확인되어 각 집단의 유전다양성이 잘 유지되어 있다고 판단된다. Markov chain procedure test를 이용하여 집단이 HWE에 따르는 지를 검토하였다. 일반넙치 집단의 PO3, PO4를 제외한 4개의 마커와 황금넙치 집단의 PO2을 제외한 모든 마커에서 Bonferroni 분석에 따라 유의적인 차이를 보였다. 영덕, 서천, 거제, 완도에 서식하는 자연집단 넙치의 유전학적 조성은 유의적 차이없이 HWE를 따르는 것으로 보고되었다(Jeong and Jeon, 2008). 또한, 6개 유전자좌를 이용하여 넙치의 양식집단과 자연집단의 HWE를 확인한 결과, 3개의 자연집단에서는 유의적인 차이없이 HWE을 따랐지만, 2개의 양식집단에서는 유의적인 차이를 보였다(Jeong et al., 2009). 이와 비교해 볼 때, 본 연구의 결과는 양식 집단의 유전적 특이성을 잘 보여준다. 자연집단에서는 개체의 유전자풀이 다양하고 무작위적으로 교배가 이루어짐으로써 그 집단의 유전적 조성이 거의 평형을 이루면서 유지된다(Zhou et al., 2011; Bohling et al., 2016). 반면에 양식집단은 비교적 적은 수의 일부 개체만 교배과정에 참여하며, 시장성 있는 형질을 보유한 개체를 선별하여 산란에 적극적으로 참여시키는 선별육종의 방법을 이용하기 때문에, 세대를 거듭하면서 생산된 종묘의 유전학적 조성이 평형을 벗어나 유전적 부동(genetic drift)이 진행된다고 판단된다(Dudgeon et al., 2006).

Table 2. Genetic diversity at 6 microsatellite makers in normal population of Paralichthys olivaceus

K, number of alleles; N, sample size; Ar, allelic richness; Hobs, observed heterozygosity; Hexp, expected heterozygosity; PIC, Polymorphism information content; Fis, inbreeding coefficients; HWE, Hardy-Weinberg equilibrium. *Significant level at P<0.01. **Significant level at P<0.001.

Table 3. Genetic diversity at 6 microsatellite makers in golden population of Paralichthys olivaceus

K, number of alleles; N, sample size; Ar, allelic richness; Hobs, observed heterozygosity; Hexp, expected heterozygosity; PIC, Polymorphism information content; Fis, inbreeding coefficients; HWE, Hardy-Weinberg equilibrium. *Significant level at P<0.001.

일반넙치 집단과 황금넙치 집단간의 대립유전자 빈도 분석

황금넙치의 체색과 관련된 마커의 대립유전자를 확인하기 위해서 일반넙치 집단과 황금넙치 집단간의 대립유전자 빈도분석을 실시하였다(Table 4). PO2 마커와 PO3 마커에서는 각각 한 개의 대립유전자가 유의적인 차이를 보였다. PO2 마커의 255 대립유전자는 일반넙치 집단과 황금넙치 집단에서 각각 0.44 그리고 0.62의 빈도가 나타났고, 교차비가 1.90 (95% CI; 1.64-2.21)로 유의적인 차이를 보였다. 반면 PO4 마커는 대립유전자 수가 각 집단에서 2개 또는 3개로 나타났으며 316 대립유전자 빈도는 각각 0 과 1, 교차비가 1.95 (95% CI; 1.81-2.10)로 분석에 이용된 모든 황금넙치 개체가 316 대립유전자를 보유하고 있었지만 일반넙치는 보유하고 있지 않았다. PO4는tyrosinase 유전자와 관련된 마커로 tyrosinase는 멜라닌 생합성 기전의 핵심적인 효소로써 색소침착과 피부노화를 유발하는 중요 인자로 알려져 있다(Wang et al., 2007; Cal et al., 2017). 또한 L-tyrosine (L-Tyr)을 L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA)로, L-DOPA를 dopaquinone으로 변환하는 촉매로 작용한다(Slominski et al., 2012; Almeida-Paes et al., 2017). Tyrosinase 발현억제가 사람과 마우스의 in vivo 및 in vitro 연구에서 멜라닌 생성을 저해하는 결과를 나타냈다(Hartmann et al., 2009; Zolghadri et al., 2019).

Table 4. Comparison of allele frequencies between normal and golden population of Paralichthys olivaceus

CI, confidence interval; LR, logistic regression. *Significant level at P<0.001.​​​​​​​

본 연구에서 개발된 MS 마커는 멜라닌 합성과 연관되어 있는 유전자의 intron 또는 flanking region에 위치하는 MS를 이용하였다. PO2와 관련된 Melanopsin A는 광반응 메커니즘을 통해서 빛을 통한 피부의 색소침착을 유발하는데, 주위 환경으로 인해 유도되는 색소조절 기전이다(Altimus et al., 2008; Chen et al., 2011; Ruby et al., 2002). Pro-opiomelanocortin 1 (POMC)는 melanocyte의 tyrosinase의 발현을 증가시키고, POMC, MCH, MCHR1으로 이어지는 신호전달 기전을 통해서 melanosome의 이동과 멜라닌 발현을 조절한다(Rogers et al., 1997). PO1 마커와 관련된 melanoma differentiation-associated gene 5 (MDA5)은 melanocyte에서 발현량이 높게 유지되는 것으로 알려져 있는데, MDA5의 발현 조절이 정상적이지 못할 때 melanocyte의 증식과 사멸을 유도하여 체색을 변화시킨다(Kang et al., 2004).

일반넙치와 황금넙치의 tyrosinase 발현 분석 연구에서 확인된 황금넙치의 tyrosinase 발현감소 결과(data not shown)와 본 연구결과를 비교해 볼 때, PO4 316 대립유전자와 발현 조절의 관련성에 대해 추가적인 연구가 필요하다고 판단된다. PO1, PO3, PO4, PO5 마커는 2개 이상의 대립유전자에서 유의적인 차이를 보였는데 각 대립유전자의 교차비가 PO1 마커 161 대립유전자의 1.24 (95% CI 1.10-1.39) 부터 PO3 마커 349 대립유전자의 1.85 (95% CI; 1.62-2.17)까지 총 11개의 대립유전자에서 통계적으로 유의적인 차이를 확인하였다.

결론적으로 본 연구에서는 황금넙치 판별을 위한 특이적 MS 마커를 개발하고자 멜라닌 합성과 관련된 6개의 유전자를 이용하여 MS 마커를 개발하였다. 개발된 마커를 이용하여 일반넙치 집단과 황금넙치 집단을 대상으로 유전형을 분석한 결과, PO4 마커를 제외하면 충분한 다형성이 나타났으며, 각 집단의 유전적 특성을 잘 반영된 결과를 보였다. 그리고 각 마커에서 일반넙치와 황금넙치를 구분할 수 있는 특정 대립유전자군을 확보하였는데, 특히 tyrosinase와 관련된 PO4 마커의 316 대립유전자는 황금넙치 집단에서 특이적으로 보유하고 있는 것으로 확인하였다. 그러나 본 연구에서 개발된 마커는 각각의 유전형에 따른 발현량의 차이와 기능적인 평가가 수행되지 않았기에, 유전형과 유전자의 관련성에 대한 추가적인 연구가 필요하다. 본 연구결과를 이용하여 황금색이 발현되지 않은 치어의 체색발현을 조기에 예측하여 양식과정에서 소요되는 제반비용을 절약할 수 있을 것으로 예상되며, 넙치 체색 연구를 위한 기초적인 자료를 제공할 수 있을 것으로 판단된다.​​​​​​​